Автор: Пользователь скрыл имя, 14 Декабря 2012 в 17:54, реферат
Для получения трансгенных животных использовались и другие методы, к которым относятся: применение сперматозоидов, обработанных экзогенной ДНК, для оплодотворения яйцеклеток в условиях in vitro; использование липосом в качестве вектора чужеродной ДНК. Однако, эти методы имеют значительно менее широкое распространение, в сравнении с методом микроинъекции чужеродной ДНК в пронуклеус зиготы.
Эффективность получения трансгенного КРС с использованием ретровирусной инфекции ооцитов в метафазе II второго мейотического деления.
Показатели |
Число (n) |
% |
Инфицированные ооциты |
836 |
|
Эмбрионы, развившиеся до бластоцисты |
174 |
21 |
Пересаженные эбрионы |
10 |
|
Живые потомки (% от пересаженных эмбрионов) |
4 |
40 |
Трансгенные животные (% от родившихся потомков) |
4 |
100 |
Преимуществом использования ретровирусных векторов для получения трансгенных животных является то, что до 100% обработанных эмбрионов могут быть успешно инфицированы ретровирусами.
Недостатком применения ретровирусных векторов является их ограниченная емкость (размер вставки не должен превышать 8 тысяч п. н. Кроме того, в результате сплайсинга из ретровирусов вырезаются интроннные последовательности, которые как и другие дистальные или проксимальные последовательности играют важную роль в эффективной экспрессии генов у трансгенноых животных [Palmiter et ai, 1991]. К недостаткам использования ретровирусных векторов следует так же отнести подавление экспрессии трансгенов in vivo вследствие инактивации вирусных промоторов в клетках, например, посредством а- и у-интерферонов, действующих на вирусные LTR [Ghazizadeh et ai, 1997]. Однако данная проблема может быть решена посредством включения в ретровирусную конструкцию внутренних промоторов или использованием нового поколения ретровирусов, содержащих модифицированные участки контроля экспрессии, такие как внутренний рибосомный сайт (IRES) [Salen, 1997] и тетрациклиновая регуляторная система [lida et ai, 1996].
Еще одним ограничением использования ретровирусных векторов для получения трансгенных животных является их низкий титр. Обычные ретровирусные векторы имеют титр 1 х 105-6 колониеобразующих единиц (cfu) в мл [Kim et ai, 1993; Archer et ai, 1994]. Низкий титр ретровирусов ограничивает способы их введения в эмбрионы. Проблема низкого титра была недавно решена посредством разработки нового вектора на основе вируса везикулярного стоматита (псевдотип VSV-G) [Burns et ai, Yee et ai, 1994]. Известно, что тропизм ретровируса определяется геном env, поэтому его замена в векторе на ген env другого ретровируса может расширить спектр хозяев и изменить свойства ретровируса. Данная технология получила название псевдотипирования. Включение белка вируса везикулярного стоматита С в вектор на основе Мо – MLV (Burns et al,1994) позволило сделать его более стабильным при ультрацентрифугировании. Данный вектор может быть сконцентрирован до титра 1x109-10 КОЕ/мл и имеет очень широкий спектор клеток-хозяев. С его использованием были получены трансгеные лини клеток насекомых, млекопитающих, амфибий, рыб, а также созданы трансгенные животные. Высокий титр ретровируса сделал возможным получение трансгенных животных посредством инъекции содержащей вирусы среды в перивителиновое пространство [Chan et al, 1998)/ В ооцитах крупного рогатого скота объем перивителинового пространства составляет 200-300 пкл. При использовании вируса с титром 1*10 9-10 КОЕ/мл, инъекция 10 пкл приводит к проникновению в перивителиальное пространство от 10 до 100 инфекционных вирусных частиц. Если титр вируса равен 1*105-6 КОЕ/мл, то для введения в эмбрион одной вирусной частицы понадобилось не менее 1 нл раствора .
К недостаткам использования
Не смотря на перечисленные недостатки
и ограничения, ретровирусы могут
быть широко использованы для трансгенеза
в животноводстве. Успешное введение
генетического материала в
Аналогичные эксперименты с использованием экспрессионного вектора pLNS, полученного на основе Mo-MLV проводятся в отделе биотехнологии Всероссийского НИИ животноводства.
LTR – длинный концевой повтор
, ψ+ - сигнал упаковки, Н4 – промотер
гистона человека, NEO – ген устойчивости
к неомицину,ЕР – делеция в
области промотера-энхансера,
Доказана возможность успешной инфекции альвеолярных клеток молочной железы свиней и коров рекомбинантными ретровирусами..
Инфекция молочной железы не носит локального характера. Последовательности провируса помимо опытных долей вымени были выявлены в контрольных долях молочной железы, в слюнной железе, селезенке, поджелудочной железе, спинном мозге, надпочечниках. ИФА молока свиней выявил наличие рекобинантного продукта в количестве от 30 до 290 нг/мл.
Основными недостатками метода непосредственной инфекции отдельных органов животных является необходимость использования большой дозы ретровирусов с тем, чтобы инфицировать достаточное число клеток, а так же невозможность передачи трансгена по наследству следующему поколению животных. Однако в отличие от введения грансгенов в эмбриональные линии, данный подход позволит синтезировать рекомбинантные продукты в молоко уже через несколько месяцев после начала эксперимента. Для КРС по сравнению с традиционным методом микроинъекции затраты времени от начала эксперимента и до получения первых результатов об уровне экспрессии в молоке сокращаются, соответственно, с 4-5 лет до 4 5 месяцев.
1.3 Метод пересадки ядер клеток, культивируемых in vitro
Еще одним способом получения трансгенных
млекопитающих является использование
трансформированных генными конструкциями
клеточных линий. С этой целью
могут быть использованы как стволовые
клеточные линии, так и соматические
клетки, культивируемые in vitro. Впервые
экспрессия генных конструкций в
соматических тканях химерных мышей, полученных
с использованием трансформированных
клеток эмбриональной карциномы, была
доказана Stewart с соавторами [1985]. Доля
химерных мышей была очень высокой,
причем часть из них передавала трансген
по наследству. Однако в настоящее
время наибольшее распространение
для получения химерных животных
получили эмбриональные стволовые
клетки, ЭСК [Robertson et al., 1986]. Преимуществом
получения трансгенных животных
с помощью трансформированных стволовых
клеток является возможность тестирования
интеграции трансгена в культуре
клеток. Это означает, что каждый
эмбрион, развившийся в культуре
после пересадки ядер, будет трансгенным
и последующая селекция трансгенных
эмбрионов не требуется. Кроме того,
пересадка таких эмбрионов
Сенсационное сообщение было опубликовано
в 1996 году в Nature. Была продемонстрирована
возможность получения
Схема получения трансгенных животных с использованием стабильно трансформированных клеток.
1.4 Липосомы как переносчики ДНК
Векторами для переноса генных конструкций
в эмбриональные линии
1.5 Использование половых клеток семенников (спермии и сперматогонии)
Сперматозоиды являются природным вектором, доставляющим ДНК в клетку. Использование спермиев в качестве переносчиков одной ДНК рассматривается как один из перспективных методов генетической модификации животных. В опытах Lavitrano (1989) 30% мышей полученных после оплодотворения обработанной ДНК спермой, оказались трансгенными и передавали трансген по наследству.
Многочисленные попытки в
Huguet и Esponda [1998] исследовали способность
сперматозоидов поглощать
Для повышения эффективности
Большое внимание в последнее время привлекают манипуляции со стволовыми клетками семенников-сперматогониями [Brinster, Nagano. 1998]. Была продемонстрирована возможность переноса сперматогониев от одного самца другому как у животных одного вида (Avarbock, 1994; Brinster и Zimmermann. 1994), так и между двумя видами.
После пересадки половых клеток
из семенников самца мыши в семенники
другого самца, до 80% потомства происходило
из сперматозоидов самца-донора. Была
доказана возможность успешного
протекания сперматогенеза после пересадки
криоконсервированных клеток семенника
и после их длительного консервирования.
Успешное длительное культивирование
половых клеток животных in uru делает
возможным проведение трансформации
сперматогониев экзогенной ДНК с
последующей селекцией. Nagano с соавторами
/2000] сообщили об успешном введении экзогенной
ДНК в сперматогонии т vitro и in vivo
посредством ретровирусной
В сочетании с пересадкой трансформированных половых клеток в семенники реципиентов и успешным протеканием сперматогенеза подход может быть использован для получения трансгенного потомства.
Не смотря на хорошие результаты
в использовании сперматозоидов
для получения трансгенных