Трансгенные животные

Автор: Пользователь скрыл имя, 14 Декабря 2012 в 17:54, реферат

Краткое описание

Для получения трансгенных животных использовались и другие методы, к которым относятся: применение сперматозоидов, обработанных экзогенной ДНК, для оплодотворения яйцеклеток в условиях in vitro; использование липосом в качестве вектора чужеродной ДНК. Однако, эти методы имеют значительно менее широкое распространение, в сравнении с методом микроинъекции чужеродной ДНК в пронуклеус зиготы.

Файлы: 1 файл

трансгенные жив.docx

— 51.89 Кб (Скачать)

Эффективность получения трансгенного КРС с использованием ретровирусной  инфекции ооцитов в метафазе II второго  мейотического деления.

 

Показатели

Число (n)

%

     

Инфицированные ооциты

836

 
     

Эмбрионы, развившиеся до бластоцисты

174

21

     

Пересаженные эбрионы

10

 
     

Живые потомки (% от пересаженных эмбрионов)

4

40

     

Трансгенные животные (% от родившихся потомков)

4

100


 

Преимуществом использования ретровирусных  векторов для получения трансгенных  животных является то, что до 100% обработанных эмбрионов могут быть успешно  инфицированы ретровирусами.

Недостатком применения ретровирусных  векторов является их ограниченная емкость (размер вставки не должен превышать 8 тысяч п. н. Кроме того, в результате сплайсинга из ретровирусов вырезаются интроннные последовательности, которые  как и другие дистальные или проксимальные последовательности играют важную роль в эффективной экспрессии генов у трансгенноых животных [Palmiter et ai, 1991]. К недостаткам использования ретровирусных векторов следует так же отнести подавление экспрессии трансгенов in vivo вследствие инактивации вирусных промоторов в клетках, например, посредством а- и у-интерферонов, действующих на вирусные LTR [Ghazizadeh et ai, 1997]. Однако данная проблема может быть решена посредством включения в ретровирусную конструкцию внутренних промоторов или использованием нового поколения ретровирусов, содержащих модифицированные участки контроля экспрессии, такие как внутренний рибосомный сайт (IRES) [Salen, 1997] и тетрациклиновая регуляторная система [lida et ai, 1996].

Еще одним ограничением использования  ретровирусных векторов для получения  трансгенных животных является их низкий титр. Обычные ретровирусные векторы  имеют титр 1 х 105-6 колониеобразующих  единиц (cfu) в мл [Kim et ai, 1993; Archer et ai, 1994]. Низкий титр ретровирусов ограничивает способы их введения в эмбрионы. Проблема низкого титра была недавно  решена посредством разработки нового вектора на основе вируса везикулярного  стоматита (псевдотип VSV-G) [Burns et ai, Yee et ai, 1994]. Известно, что тропизм ретровируса  определяется геном env, поэтому его  замена в векторе на ген env другого  ретровируса может расширить  спектр хозяев и изменить свойства ретровируса. Данная технология получила название псевдотипирования. Включение  белка вируса везикулярного стоматита  С в вектор на основе Мо – MLV (Burns et al,1994) позволило сделать его более  стабильным при ультрацентрифугировании. Данный вектор может быть сконцентрирован  до титра 1x109-10 КОЕ/мл и имеет очень  широкий спектор клеток-хозяев. С  его использованием были получены трансгеные лини клеток насекомых, млекопитающих, амфибий, рыб, а также созданы  трансгенные животные. Высокий титр ретровируса сделал возможным получение  трансгенных животных посредством  инъекции содержащей вирусы среды в  перивителиновое пространство [Chan et al, 1998)/ В ооцитах крупного рогатого скота объем перивителинового пространства составляет 200-300 пкл. При использовании  вируса с титром 1*10 9-10 КОЕ/мл, инъекция 10 пкл приводит к проникновению  в перивителиальное пространство от 10 до 100 инфекционных вирусных частиц. Если титр вируса равен 1*105-6 КОЕ/мл, то для введения в эмбрион одной  вирусной частицы понадобилось не менее 1 нл раствора .

К недостаткам использования ретровирусов относится возможность клеточных  онкогенов посредством вирусных транскрипционных последовательностей. Даже при применении ретровирусов, которые не могут существовать как  инфекционные вирусные частицы, существует хотя и очень небольшой, но риск, что при рекомбинации с присутствующими  в эмбрионах эндогенными ретровирусными последовательностями могут образовываться новые активные формы ретровирусов.

Не смотря на перечисленные недостатки и ограничения, ретровирусы могут  быть широко использованы для трансгенеза  в животноводстве. Успешное введение генетического материала в ооциты делает возможным проведение генной терапии наследственных заболеваний. Использование ретровирусных векторов позволяет осуществлять трансформацию  отдельных органов. Так, Archer с соавторами [1994] ввели в молочную железу козы путем инфузии через сосковый канал в период гормонально индуцируемого  маммогенеза ретровирус, кодирующий гормон роста человека (hGH). Лактация наступила на 14-ый день гормональной обработки. Максимальный уровень hGH (60 нг/мл) наблюдался в первый день лактации и затем опускался до 12 нг/мл на 9-12 дни лактации.

Аналогичные эксперименты с использованием экспрессионного вектора pLNS, полученного  на основе Mo-MLV проводятся в отделе биотехнологии  Всероссийского НИИ животноводства.

LTR – длинный концевой повтор , ψ+ - сигнал упаковки, Н4 – промотер  гистона человека, NEO – ген устойчивости  к неомицину,ЕР – делеция в  области промотера-энхансера, рА  – сигнал полиаденилирования  Данный вектор содержит только  цис-действующие последовательности  генома вируса, необходимые для  репликации. Последовательности вируса, кодирующие белки, исключены из  векторной конструкции. Вектор  содержит 5' длинный концевой повтор LTR, с которого происходит транскрпция,  ψ+ область, ответственную за  упаковку вирусного генома в  вирион, ген устойчивости к неомицину,  под контролем промотера Н4  гистона человека для селективного  введения конструкции в клеточную  линию и 3' LTR с делецией в  области промотера-энхансера вируса. После одного цикла репликации  делеция в области ЕР LTR будет  присутствовать на обоих концах  провируса, регуляторные элементы  провируса будут полностью инактивированы  и клонированные гены будут  экспрессироваться только под  контролем собственных промотеров.

Доказана возможность успешной инфекции альвеолярных клеток молочной железы свиней и коров рекомбинантными  ретровирусами..

Инфекция молочной железы не носит  локального характера. Последовательности провируса помимо опытных долей  вымени были выявлены в контрольных  долях молочной железы, в слюнной  железе, селезенке, поджелудочной железе, спинном мозге, надпочечниках. ИФА  молока свиней выявил наличие рекобинантного продукта в количестве от 30 до 290 нг/мл.

Основными недостатками метода непосредственной инфекции отдельных органов животных является необходимость использования  большой дозы ретровирусов с тем, чтобы инфицировать достаточное  число клеток, а так же невозможность  передачи трансгена по наследству следующему поколению животных. Однако в отличие  от введения грансгенов в эмбриональные  линии, данный подход позволит синтезировать  рекомбинантные продукты в молоко уже  через несколько месяцев после  начала эксперимента. Для КРС по сравнению с традиционным методом  микроинъекции затраты времени  от начала эксперимента и до получения  первых результатов об уровне экспрессии в молоке сокращаются, соответственно, с 4-5 лет до 4 5 месяцев.

 

1.3 Метод пересадки ядер  клеток, культивируемых in vitro

 

Еще одним способом получения трансгенных  млекопитающих является использование  трансформированных генными конструкциями  клеточных линий. С этой целью  могут быть использованы как стволовые  клеточные линии, так и соматические клетки, культивируемые in vitro. Впервые  экспрессия генных конструкций в  соматических тканях химерных мышей, полученных с использованием трансформированных клеток эмбриональной карциномы, была доказана Stewart с соавторами [1985]. Доля химерных мышей была очень высокой, причем часть из них передавала трансген по наследству. Однако в настоящее  время наибольшее распространение  для получения химерных животных получили эмбриональные стволовые  клетки, ЭСК [Robertson et al., 1986]. Преимуществом  получения трансгенных животных с помощью трансформированных стволовых  клеток является возможность тестирования интеграции трансгена в культуре клеток. Это означает, что каждый эмбрион, развившийся в культуре после пересадки ядер, будет трансгенным  и последующая селекция трансгенных  эмбрионов не требуется. Кроме того, пересадка таких эмбрионов реципиентам  приведет к рождению только трансгенного потомства. Использование для получения  трансгенных животных трансформированных ЭСК делает возможным в ряде случаев  проводить оценку экспрессии трансгенов, что имеет немаловажное значение. При микроинъекции трансгены  наугад интегрируются в любую  часть генома. Это означает, что  они могут разрушать весьма существенные гены (инсерционные мутации) или размещаться  в тех частях хромосомы, которые  недоступны для транскрипции. Тестирование экспрессии в культуре сделает возможным  использование для пересадки  ядер, а следовательно и для  получения трансгенных животных только тех клеточных линий, в  которых трансгены являются транскрипционно и трансляционно активными. Кроме того, в отличие от метода пронуклеарной инъекции исследование ЭСК позволяет целенаправленно воздействовать на геном посредством генного хххххххххх

Сенсационное сообщение было опубликовано в 1996 году в Nature. Была продемонстрирована возможность получения жизнеспособных овец посредством пересадки ядер соматических клеток, культивируемых in vitro. Позже сообщили о получениитрансгенных овец посредством пересадки ядер стабильно трансформированных первичных  фетальных фибробластов (Schnieke et al., 1997). Из шести полученных трансгенных  ягнят пять оказалось жизнеспособными. Степень трансгенности при использовании  данной, метода составляла 100%, в то время  как применение метода микроинъекции  в той же лаборатории позволяло  получить лишь 4,35% трансгенных потомков от числа родившихся животных. Для  получения одного трансгенного ягненка  методом пересадки ядер требовалось 20,8 овец, в то время как при  использовании метода пронуклеарной  инъекции - 51,4 овцы [Schnieke et at., 1997]. Как  и при использовании ЭСК, данный метод позволяет проводить анализ интеграции в культуре клеток, а  также осуществлять целенаправленное встраивание генных конструкций  в желаемые участки генома. Кроме  того, используемые клеточные линии  могут быть кариотипизированы в  культуре, что позволит заранее предопределять пол трансгенных животных. После  получения трансгенных животных из различных клеточных линий  и определения уровня экспрессии может быть произведен отбор желательных  клонов для их дальнейшего использования  в пересадках ядер.

Схема получения трансгенных животных с использованием стабильно трансформированных клеток.

 

1.4 Липосомы как переносчики  ДНК

 

Векторами для переноса генных конструкций  в эмбриональные линии млекопитающих  могут служить липосомы [Rottmann et al, 1985], однако опосредованный ими перенос  генов не получили широкого распространения

 

1.5 Использование половых  клеток семенников (спермии и  сперматогонии)

 

Сперматозоиды являются природным  вектором, доставляющим ДНК в клетку. Использование спермиев в качестве переносчиков одной ДНК рассматривается  как один из перспективных методов  генетической модификации животных. В опытах Lavitrano (1989) 30% мышей полученных после оплодотворения обработанной ДНК спермой, оказались трансгенными и передавали трансген по наследству.

Многочисленные попытки в других лабораториях неуспешными. Анализ 1300 мышей, родившихся in vitro обработанной ДНК спермой, не выявил трансген ни у одной из исследованных особей [Brinster, 1989), Недавнее исследования показали, что при применении метода переноса ДНК посредством  сперматазоидов в одной и той  же лаборатории дае пра использовании  одинаковой схемы исследований могут  быть получены противоречивые результаты [Maiore et al, 1998]. Это позволяет предположить, что встраивание ДНК происходит только на определенной стадии клеточного цикла. Однако до настоящего времени  не установлен механизм интеграции экзогенной ДНК в геном сперматозоидов.

Huguet и Esponda [1998] исследовали способность  сперматозоидов поглощать линейную  ДНК in vitro и in vivo. В опытах in vitro отмытые придатковые сперматозоиды  инкубировали 2 часа с линейной  ДНК. ДНК инъецировали в проксимальную  область семенных канальцев, после  чего через 6 часов извлекали  сперматозоиды. Присутствие чужеродной  ДНК было показано у 60-70% сперматозоидов. Сперматозоиды способны поглощать  ДНК, аккумулировать ее в ядре. Секркты придатков и семенных  канальцев не блокируют этот  процесс.

Для повышения эффективности связывания ДНК со сперматозоидами используют различные методы: ДНК-липосомные комплексы [Bachiller et al.. 1991], инъекцию в семенники [Sato et al.. 1994], непосредственную инъекцию в семенные канальцы [Kim et al.. 1997] и  придатки [Huguet и Esponda, 1998], инъекцию в  семенные канальцы с последующей  электропорацией [Yamazaki et al.. 1998], ко-инъекцию головок спермиев и ДНК в ооциты [Perry et al. 1999]. Также было показано, что  экзогенная ДНК может быть эффективно доставлена в ооциты микроинъецированными сперматозоидами.

Большое внимание в последнее время  привлекают манипуляции со стволовыми клетками семенников-сперматогониями [Brinster, Nagano. 1998]. Была продемонстрирована возможность переноса сперматогониев от одного самца другому как у животных одного вида (Avarbock, 1994; Brinster и Zimmermann. 1994), так и между двумя видами.

После пересадки половых клеток из семенников самца мыши в семенники  другого самца, до 80% потомства происходило  из сперматозоидов самца-донора. Была доказана возможность успешного  протекания сперматогенеза после пересадки  криоконсервированных клеток семенника  и после их длительного консервирования.пересадке  в семенники мышей клеток из семенников поздних стадий сперматогенеза половых  клеток доноров выявлено не было /Dobnnski et al., 1999].

Успешное длительное культивирование  половых клеток животных in uru делает возможным проведение трансформации  сперматогониев экзогенной ДНК с  последующей селекцией. Nagano с соавторами /2000] сообщили об успешном введении экзогенной ДНК в сперматогонии т vitro и in vivo посредством ретровирусной системы  доставки. Экспрессия ретровирусной  генной конструкции, включающей lacZ, наблюдалась  в семенниках более 6 месяцев. Анализ показал, что по крайней мере 1 из 300 стволовых клеток семенников содержали  трансген.

В сочетании с пересадкой трансформированных половых клеток в семенники реципиентов  и успешным протеканием сперматогенеза подход может быть использован для  получения трансгенного потомства.

Не смотря на хорошие результаты в использовании сперматозоидов для получения трансгенных мышей, а так же отдельные успешные попытки  получения трансгенных свиней и  КРС [Gandolfl et al, 1989, Schelander et al, 1995, Sperandio et al, 1996], каких-либо значительных успехов  в получении трансгенных сельскохозяйственных животных с помощью трансформированных сперматогониев и спермиев до настоящего времени достигнуто не было. Достижения в использовании трансгенных  технологий.

Информация о работе Трансгенные животные