Производство и промышленное использование ферментов

     2. Производство и промышленное  использование ферментов 

     2.1 Значение ферментов,  источники их получения 

          Ферменты (энзимы) - катализаторы белковой  природы, образующиеся и функционирующие  во всех живых организмах. Ферменты  не изменяются и не расходуются  в процессе реакции, ускоряют  только те реакции, которые  могут протекать и без них.  Скорость протекания реакции  при участии ферментов на несколько  порядков выше, чем под влиянием  химических катализаторов. Для  ферментативных реакций характерен  почти 100% выход продуктов. Ферменты  обладают узкой специфичностью, действуют только на те же вещества, превращение которых они катализируют. В настоящее время в природе обнаружено свыше 3 тысяч ферментов.

     Большинство биотехнологий основано на использовании  биокатализаторов, потребность в  которых постоянно возрастает. Единственным, неограниченным источником ферментов  являются микроорганизмы, из которых  можно выделить любые из известных  в настоящее время ферментов. Исключение составляет папаин (размягчитель мяса), который получают из плодов папайи. Продуктивность штаммов микроорганизмов, производящих ферменты, можно увеличить с помощью мутагенных факторов в 2…5 раз. Пересадкой плазмид получают количество ферментов, достигающее 50% массы продуцируемого белка.

     Синтезируемые микроорганизмами ферменты подразделяются на внеклеточные и внутриклеточные. К внеклеточным ферментам относятся амилаза, целлюлаза, лактаза, липаза, пектиназа, протеаза, к внутриклеточным - аспарагиназа. каталаза, инвертаза.

     Внеклеточные  ферменты получают из культуральной жидкости, предварительно отделанной от микроорганизмов. Для выделения внутриклеточных ферментов разрушают клеточные оболочки с помощью механических, физических, химических (действие кислот, растворителей), ферментативных и биологических методов.

     Ферменты  применяются в пищевой, фармацевтической, текстильной, кожевенной и других отраслях промышленности, в медицине, сельском хозяйстве, химическом синтезе.

     Более широкое технологическое применение ферментов до последнего времени  сдерживалось рядом причин, из которых  важнейшими являются:

     1) трудоемкость отделения ферментов  от исходных реагентов и продуктов  реакции;

     2) неустойчивость ферментов при  хранении, различных воздействиях (тепловых);

     3) трудоемкость очистки ферментов  и получения их в активном  виде. 

     2.2 Промышленные ферментные препараты 

     Использование микробных ферментов в некоторых  отраслях промышленности началось более 70 лет назад. Большую часть, составляют гидролазы (реакции гидролиза), так  как именно они являются основными в промышленной биотехнологии. От общего количества потребляемых ферментов 99% выпуска приходится на 16 препаратов.

     Рассмотрим  подробнее некоторые группы ферментов.

     К амилолитическим ферментам относятся L-амилаза, ß-амилаза, глюкоамилаза. Их действие проявляется при гидролизе крахмала и гликогена. Крахмал при гидролизе сначала расщепляется на более простые полисахариды - декстрины, а затем - до  глюкозы.

     Эти ферменты применяются в спиртовой  промышленности, хлебопечении.

     Протеолитические  ферменты относятся к гидролазам, образуя группу пептидгидролаз. Их действие заключается в ускорении гидролиза пептидных связей в белках и пептидах. Важная их особенность - выборочный, селективный характер действия на пептидные связи в белковой молекуле. Например, пепсин действует только на связь с ароматическими аминокислотами, трипсин - только на связь между аргинином и лизином. Из них рН 1,5…3,7 имеют кислые протеазы; рН 6,5…7,5 - протеазы; рН> 8,0 - щелочные протеазы.

     Применение  протеаз широкое: мясная промышленность для умягчения мяса, кожевенная промышленность - при обезволошивании (удаление волосяного покрова) и размягчении шкур; кинопроизводство - для растворения желатинового слоя на пленках при их регенерации; парфюмерия - при создании добавок в зубную пасту, кремы, лосьоны, промышленность синтетических моющих средств - при применении моющих добавок для удаления загрязнений белковой природы; медицина - при лечении воспалительных процессов, ожогов, тромбозов.

     Пектолитические ферменты объединены в одну группу по внешнему проявлению своего действия - уменьшению молекулярной массы и снижению вязкости пектиновых веществ (пектин - пектиновые кислоты и протопектин) представителей полисахаридов. Они содержатся во фруктах, корнеплодах, стеблях (лен). Пектиновые вещества имеют молекулярную массу от 20000 до 200000. Все пектиназы делятся на два вида - гидролазы и трансэлиминазы. Применение в текстильной промышленности - вымачивание льна перед его переработкой, в виноделии - осветление вин, уничтожение мутности, в консервировании - при приготовлении фруктовых соков.

     Целлюлолитические ферменты очень специфичны, их действие проявляется лишь в деполимеризации молекул целлюлозы, обычно они действуют в виде комплекса, который в целом доводит гидролиз целлюлозы до глюкозы. Использование их очень перспективно в гидролизной промышленности - это получение глюкозы из целлюлозы; в медицинской - выделение лекарственных веществ (стероидов) из растений; в пищевой - улучшение качества растительных масел; в сельском хозяйстве - как добавки в комбикорма для жвачных животных. В мире производится около 530 т протеаз, 350 т глюкоамилазы, 350 т L-амилазы,    70 т глюкозоизомеразы. 

     2.3 Факторы, влияющие на биосинтез ферментов 

     Существует  мнение, что из клеток микроорганизмов  можно выделить любые из известных  ферментов. Большинство микроорганизмов  способно расти на относительно простых  и дешевых питательных средах. Преодоление трудностей, связанных  с их производством и использованием, связано с получением иммобилизованных ферментов.

     Иммобилизация ферментов - это перевод их в нерастворимое  состояние с сохранением (частичным  или полным) каталитической активности.

     Для получения иммобилизованных ферментов  обычно применяют следующие методы:

     1. Ковалентные присоединение молекул  ферментов к          водонерастворимому носителю, в качестве которого используют как органические (природные и синтетические) полимеры, так и неорганические материалы. К первым относятся целлюлоза, хитин, агароза, декстрины, бумага, ткани, полистирол, ионообменные смолы и так далее.  Ко вторым - пористое стекло, силикагели, силохромы, керамика, металлы и другие.

     2.            Захват фермента в сетку геля  или полимера.

     3.            Ковалентная сшивка молекул фермента  друг с другом или с инертными  белками (при помощи би - или полифункционального реагента).

     4.            Адсорбция фермента на водонерастворимых носителях (часто на ионитах).

     5.     Микрокапсулирование (захват раствора фермента в полупроницаемые капсулы размером 5-300 мкМ). В результате иммобилизации ферменты приобретают преимущества гетерогенных катализаторов. Их можно удалять из реакционной смеси и отделять от субстратов и продуктов ферментативной реакции) простой фильтрацией.

     Иммобилизованные  ферменты более устойчивы к внешним  воздействиям, чем растворимые ферменты.

     Принцип иммобилизации был применен не только к ферментам, но и к их субстратам - веществам, имеющим избирательное  средство к ферментам. Это позволило  создать метод выделения и  очистки ферментов, основанный на хроматографии  по сродству. Облегчилось выделение  чистых ферментов.

     В последнее время применяют иммобилизованные клетки микроорганизмов, содержащих естественный набор ферментов. Отпадают стадии выделения, очистки и иммобилизации ферментов. Ферменты в микроорганизме находятся  в наиболее естественном окружении, что положительно сказывается на их термостабильности и операционной стабильности (продолжительности работы в условиях опыта). Ферменты в составе клеток микроорганизмов долго сохраняют каталитические свойства. Они также являются гетерогенными биокатализаторами со всеми преимуществами их использования в технологических целях.

     Иммобилизация клеток обычно проводится их адсорбцией на водонерастворимых носителях (часто на ионообменных смолах), ковалентной сшивкой с помощью бифункциональных реагентов (например, глутарового альдегида) или захвата их в полимер, как правило, с последующим формованием в виде частиц определенного размера и конфигурации.

     Иммобилизация целых клеток микроорганизмов предотвращает  их размножение и обычно увеличивает  сохранность и срок работы в качестве катализатора по сравнению с необработанными  клетками.

     Состав  и количество синтезируемых клетками ферментов зависит от наследственных свойств данного организма. Под  действием мутагенных факторов (ионизирующее и неионизирующее излучения, изотопы, антибиотики, химические соединения, обладающие высокой преобразующей способностью по отношению к наследственным элементам  клетки), получают промышленно ценные штаммы мутантов.

     Производительность  технологических процессов по каждому  ферменту зависит и от питательной  среды, имея в виду наличие в ней  не только источников углерода, азота, фосфора и других элементов, но и  веществ, играющих роль индукторов или  репрессоров биосинтеза данного  конкретного фермента или их групп. Например, фермент липаза почти не синтезируется грибом  на среде  без индуктора, внесение кашалотового жира усиливает биосинтез фермента в сотни раз. Этот же вид гриба  при добавлении в среду крахмала и полном исключении минерального фосфора  интенсивно синтезирует другой фермент - фосфатазу.

     Для интенсификации процесса роста и  синтеза ферментов часто добавляют  всевозможные вытяжки или экстракты, содержащие дополнительные факторы  роста. К ним относятся, прежде всего, аминокислоты. Они легко проникают  внутрь клетки и специфически влияют на образование фермента. Механизм их действия заключается в компенсации  недостающих свободных внутриклеточных  аминокислот, необходимых для синтеза  фермента. Факторами роста являются также пуриновые основания и  их производные, РНК и продукты ее гидролиза. Все рассмотренные факторы  должны учитываться при составлении  питательных сред для культивирования  продуцентов ферментов. В промышленных средах в качестве источников органического  углерода и азота чаще всего используют различные сорта крахмала (картофельный, кукурузный, рисовый), кукурузный экстракт, соевую муку и т. д. Микроорганизмы для  своего роста могут утилизировать  и минеральные соединения азота, которые превращаются в аммиак, необходимый  для синтеза сложных азотсодержащих органических соединений.

     Оптимальный состав питательной среды для  каждого продуцента может быть определен  двумя способами: методом эмпирического  подбора и с использованием математических методов оптимизации (ЭВМ).

     Все технологические процессы производства ферментных препаратов делятся на две  принципиально отличные группы: в  первом случае ферментация ведется  глубинным методом в жидкой питательной  среде, во втором используется поверхностная  культура, растущая на специально подготовленной рыхлой и увлажненной питательной  среде. 

     2.4 Применение ферментативных препаратов 

     Ферменты  немикробного происхождения находят  применение сравнительно реже в силу различных причин, в частности: низкой Лабильности, дороговизны, сезонности получения и других факторов. Но в ряде случаев, в отсутствие микробного аналога, для коммерческих целей  выделяют ферменты растительного и  животного происхождения. Примерами  таких ферментов могут служить  ренин животного происхождения, фицин выделенный из инжира, папаин и др. Для получения в производственном масштабе ферментов растительного и животного происхождения в последнее время с успехом используют культивирование тканей и отдельных органов.  Предположительно этот метод должен значительно удешевить и соответственно увеличить удельную долю коммерческих ферментов растительного происхождения.

       Хотя промышленные ферменты иногда  реализуются в виде технических  препаратов, определенная их часть  подвергается экстракции и очистке.  При этом решается несколько  задач: удаляют токсичные и  нежелательные метаболиты и микроорганизмы, стандартизуют активность. Таким  образом обеспечивается более высокое качество препарата и его стабильность, также можно придать препарату желаемые аромат и цвет. Главная трудность возникает из-за неоднородного состава культуральных  жидкостей, которые часто содержат большие количества коллоидов и имеют высокую вязкость.

       По данным 1990 г., на мировом рынке  коммерческий оборот от реализации  технических ферментных препаратов  составил 800 млн. долларов. 80% всех  производимых технических ферментов  используется в следующих трех  отраслях промышленности: гидролиз  крахмала - 40%, производство детергентов  - 30%, производство сыра-10%.

            Основу промышленной переработки  крахмала составляет возможность  его превращения в сбраживаемые сахара (глюкоза, мальтоза, изомальтоза), концентрированные сахара-сиропы (глюкоза, фруктоза) и низкомолекулярные олигосахариды-декстрины. Эти соединения используются при производстве ряда пищевых продуктов и напитков. Из существующих методов гидролиза крахмала (кислотный, ферментативный) ферментативный обладает рядом несомненных преимуществ.