Позиционное клонирование, прогулка и прыжки по хромосоме, идентификация и изоляция генов

Раздел 5. Позиционное клонирование, прогулка и прыжки по хромосоме, идентификация  и изоляция генов.

Средние размеры гена составляют около 10-30 кб, варьируя в широких пределах. Единицы рекомбинации, размеры цитогенетических бэндов и субхромосомных фрагментов ДНК измеряются миллионами пар нуклеотидов, также как и размеры фрагментов ДНК, выделяемых с помощью обработки геномной ДНК редкощепящими эндонуклеазами, пульсирующего электрофореза и клонирования в дрожжевых минихромосомах. Переход от этих крупных фрагментов к последовательностям ДНК, сопоставимым с размерами гена, осуществляют с помощью молекулярного клонирования, то есть получения набора фаговых или космидных клонов, содержащих относительно небольшие последовательности, насыщаяющие или полностью перекрывающие крупный сегмент ДНК, предположительно содержащий идентифицируемый ген. Затем проводят упорядочивание клонов в соответствии с взаимным расположением инсертированных в них фрагментов ДНК, осуществляя одновременно молекулярный анализ этих фрагментов с целью идентификации регуляторных или кодирующих областей генов.

Для молекулярного клонирования используют различные подходы. Прежде всего, это насыщающее клонирование, то есть изоляция из хромосом-специфических библиотек нескольких сотен клонов с целью картирования различными методами инсертированных в них фрагментов ДНК и идентификации клонов с последовательностями, локализованными в заданном районе. Значительно чаще используется тактика скринирования фаговых, космидных библиотек, сконструированных из субхромосомальных сегментов ДНК, предварительно отобранных на основании сцепления с различными ДНК-маркерами. При этом методы выделения субхромосомальных сегментов ДНК могут быть самыми различными. Дальнейший поиск в библиотеках генов клонов, содержащих транскрибируемые последовательности ДНК, осуществляют достаточно трудоемкими методами, получившими название "прогулки" и "прыжков" по хромосоме."Прогулка" по хромосоме или скользящее зондирование  заключается в последовательном отборе клонов, содержащих частично перекрывающиеся фрагменты ДНК из определенного района генома. На первом этапе проводят скрининг библиотеки с помощью маркерной ДНК, сцепленной с геном. После нахождения положительных клонов последние сами служат зондами для изоляции других клонов, содержащих перекрывающиеся последовательности ДНК. Таким образом, каждый раз отобранный фрагмент используется в качестве скринирующего ДНК-зонда для последующего поиска. В результате получют набор клонированных фрагментов ДНК, полностью перекрывающих область поиска гена. Группа подобных клонов носит название "контигов". С помощью физического картирования инсертированной ДНК в разных клонах удается точно установить степень перекрывания между соседними фрагментами и соответственно упорядочить положение клонов в "контигах". При скринировании космидных библиотек с выявлением каждого нового клона к участку ДНК, полностью перекрытому отобранн-ми зондами, в среднем добавляется около 20 кб. Таким способом, однако, редко удается пройти более 200 - 300 кб в одном направлении из-за наличия в геноме повторяющихся и трудно клонируемых последовательностей ДНК.

Для преодоления этих ограничений  и ускорения процесса поиска генных последовательностей американским исследователем Фрэнком Коллинзом, ныне президентом Программы Геном  Человека, был разработан метод "прыжков" по хромосоме. Этот метод позволяет  изолировать фрагменты ДНК, отстоящие  в геноме друг от друга на сотни  тысяч нуклеотидов (длина прыжка), не изолируя при этом все промежуточные последовательности ДНК (Collins, Weissman, 1984). Прыжки начинаются со стартового зонда, то есть с последовательности, гибридизующейся со сцепленным с геном ДНК-маркером. Предварительно геномная ДНК переваривается редкощепящей рестриктазой, в результате чего образуются большие фрагменты ДНК, соответствующие по длине одному прыжку. Затем, эти фрагменты переводятся в кольцевую форму за счет искусственного присоединения к их концам небольшого маркерного гена. При этом концы рестрикционных фрагментов сближаются. Кольцевые молекулы ДНК разрезают среднещепящими рестриктазами и из пула относительно небольших фрагментов ДНК отбирают те, которые содержат маркерный ген, а, следовательно, и окружающие его концевые участки исходных крупных фрагментов. Отобранные последовательности клонируют в фаговых или космидных векторах, получая библиотеку генов концевых участков. Затем в этой библиотеке проводят скрининг клонов, содержащих стартовый зонд. Только в этих клонах комплементарные зонду последовательности соединены маркерным геном с последовательностями ДНК, отстоящими от стартового участка поиска на длину прыжка. При необходимости промежуточные сегменты ДНК также могут быть клонированы с использованием метода скользящего зондирования. Остановимся теперь на тех критериях, по которым можно отличить сегменты ДНК, являющиеся частями генов, от любых других последовательностей (Рис.3.7.) (Lindsay, Bird, 1987;Rommens et al., 1989; Wicking, Williamson, 1991; Collins,1992). Условно эти критерии могут быть разделены на три группы. В первой группе исследуют структурные особенности генных последовательностей. Вторая группа критериев основана на поиске функциональных участков генов. В третьем случае анализируют характер нуклеотидных последовательностей тестируемых фрагментов ДНК. Диагностику структурных участков генов осуществляют путем гибридизации с ДНК-зондами или прямым скринированием кДНК-овых библиотек. Функциональная диагностика генов включает улавливание экзонов (exon trapping), промоторных участков, поли-A сигнальных последовательностей, а также перенос генов в иные конструкции и идентификацию в них соответствующих транскриптов. И, наконец, поиск генов может быть осуществлен путем прямого секвенирования крупных фрагментов ДНК с последующим компьютерным анализом нуклеотидной последовательности и сопоставлением её с присутствующими в базах данных идентифицированными генами других видов живых существ.

Как уже отмечено ранее, кодирующие области генов, представленные в геноме уникальными последовательностями, достаточно консервативны в процессе эволюции. Существует высокий процент гомологии в структуре ДНК между одинаковыми генами у разных видов млекопитающих. На этом факте основан, так называемый зооблот - скрининг клонированных последовательностей, не содержащих повторов, но дающих перекрестную гибридизацию с геномной ДНК, выделенной из разных видов животных - приматов, сельскохозяйственных животных, грызунов,птиц, рептилий. Клоны, содержащие консервативные последовательности, подвергают дальнейшему анализу на присутствие в инсертированных фрагментах ДНК CpG островков, часто маркирующих 5'-фланкирующие области генов позвоночных, особенно генов домашнего хозяйства ( см.Главу II,2.4), и исследуют наличие открытых рамок считывания -ORF (open reading frames).Дальнейший поиск генов в более узком интервале может быть осуществлен с помощью компьютерного анализа соответствующей нуклеотидной последовательности ДНК. Кроме того, все клонированные ДНК из этого интервала могут быть сразу использованы для анализа РНК-транскриптов (Iannuzzi, Collins, 1990).Важным доказательством принадлежности клонированной ДНК гену является идентификация гомологичных РНК транскриптов в тканях, где можно предполагать экспрессию этого гена. С этой целью проводят гибридизацию уже отобранных по первым двум критериям клонов ДНК с тотальной мРНК, выделенной из этих тканей, а также скринируют соответствующие кДНК-овые библиотеки. Для генов наследственных заболеваний с неизвестным первичным биохимическим дефектом библиотеки конструируют из пораженных органов и тканей. При обнаружении последовательностей кДНК, гибридизующихся с геномными зондами, их, в свою очередь, используют для зондирования библиотеки и выявления всех клонов с перекрывающимися последовательностями кДНК. К сожалению, для генов с низким уровнем экспрессии гибридизация может не дать положительных результатов.

Выделенные клоны, удовлетворяющие  перечисленным критериям, с большой  вероятностью содержат последовательности ДНК,являющиеся частями гена. Однако, всегда существует опасность выбора какого-то другого гена (или псевдогена), локализованного в той же области ДНК. Поэтому требуются дополнительные доказательства идентичности выбранной последовательности ДНК специфическому гену. Такие доказательства могут быть получены, например, при определении нуклеотидной последовательности кДНК и сопоставлении ее с аминокислотной последовательностью кодируемого этим геном белка. Веским доказательством в пользу правильности проведенной идентификации гена может быть обнаружение мутантных вариантов аллелей в изолированных последовательностях ДНК у больных, страдающих соответствующим наследственным заболеванием. Так, например,при идентификации гена муковисцидоза, у 70% больных в клонируемой кДНК последовательности была обнаружена однотипная мутация - делеция трех нуклеотидов - delF508. Наконец, решающим аргументом правильности идентификации нужного гена является успешно осуществленная с его помощью генокоррекция первичного биохимического дефекта, выполненная на соответствующих культурах мутантных клеток, или получение стойкого терапевтического эффекта у трансгенных животных - биологических моделей данного наследственного заболевания.Определение размера молекул мРНК, гибридизующихся с геномными клонами, дает оценку суммарной величины гена. Эта оценка имеет важное значение для реконструирования полноразмерной кДНК. Её клонирование, по-сути, означает идентификаию гена, так как позволяет определить его границы в геномной ДНК, охарактеризовать его экзонно-интронную структуру и регуляторные элементы. Зная первичную нуклеотидную последовательность кДНК, можно с уверенностью прогнозировать аминокислотную последовательность соответствующего белка и таким образом определить первичное биохимическое звено в патогенезе соответствующего наследственного заболевания.

Описанный способ изучения молекулярных и биохимических основ  наследственных заболеваний получил  название обратной генетики, а сам  процесс в отличие от традиционного  пути от белка к гену, так называемого  функционального клонирования,был назван позиционным клонированием, тем более, что термин обратной генетики уже использовался ранее для обозначения метода анализа функции гена путем направленного введения в него мутаций (Collins, 1992).

Возможность использования  функционального клонирования зависит  от доступности информации о белковом продукте и/или о функции соответствующего гена. Для подавляющего большинства  моногенных болезней определение первичного биохими-ческого дефекта представляет собой очень трудную задачу из-за недостаточного понимания функционирования огромного числа клеточных ферментов, сложностей их взаимодействия,низких концентраций, отсутствия эффективных методов выделения и очистки а, зачастую, даже из-за отсутствия сведений о клетках - мишенях, в которых следует искать первичный биохимический дефект. Поэтому на фоне стремительного роста данных о структуре генома чеовека и, прежде всего, о насыщенности генами и анонимными ДНК маркерами отдельных хромосом и их сегментов, реальные соотошения функционального и позиционного клонирования в идентификации генов, ответственных за наследственные заболевания, быстро меняются в сторону безусловного доминирования последнего.

Успех позиционного клонирования определяется возможностями картирования гена, при этом функция гена исследуется  уже после его идентификации  и клонирования. На рис. 3.8 представлена общая схема позиционного клонирования, заимствованная из работы Коллинза (Collins, 1992). Обычно, для нахождения положения неизвестного гена на карте сцепления используют 100 - 200 полиморфных маркеров. После обнаружения хромосомной принадлежности картируемого гена более точная локализациия может быть установлена с помощью прицельного отбора дополнительных индексных маркеров из определенного цитогенетического сегмента. Картирование гена, определяющего наследственное заболевание, может быть значительно ускорено при наличии у какого-то больного цитогенетически видимой структурной перестройки в области локализации этого гена, чаще всего делеции или транслокации. Хотя такие пациенты, как правило, встречаются редко, но описание даже одного такого случая может исключить необходимость картирования гена путем последовательного анализа его сцепления с генетическими маркерами целого генома и позволит перейти непосредственно к молекулярному клонированию. Именно таким образом были идентифицированы гены хронического грануломатоза,миопатии Дюшенна, ретинобластомы, X-сцепленной глухоты, ней-рофиброматоза I, аниридии и некоторых других наследственных болезней.

С другой стороны, в ряде случаев удается исключить длительный процесс молекулярного клонирования, используя метод"кандидатного гена". Разработка методов, облегчающих нахождение транскрибируемых областей генома, улавливание экзоновби регуляторных участков генов, секвенирование и картирование методами гибридизации in situ большого количества анонимных кДНК последовательностей, изолированных из тканеспецифических библиотек, все это в комплексе приводит к значительному увеличению степени насыщенности различных сегментов хромосом известными генными последовательностями, среди которых и осуществляют поиск гена-кандидата. Большая роль в этих исследованиях принадлежит также мутантным генетическим линиям животных, моделирующим различные наследственные заболевания человека (см Глава VIII). Значительное сходство нуклеотидных последовательностей кодирующих участков гомологичных генов млекопитающих и человека, наличие большого числа консервативных групп сцепления с наборами идентичных генов позволяют успешно вести параллельные исследования геномов человека и других животных, значительно ускоряющие эффективность поиска и молекулярного анализа индивидуальных генов человека (Dietrich et al., 1994; Copeland et al, 1993).Молекулярная идентификация генов открывает широкие возможности для анализа тканеспецифической регуляции их экспрессии в процессе развития организма на всех уровнях от транскрипции до трансляции. Следуюшим этапом молекулярного анализа является генотипирование мутаций и исследование тех нарушений в структуре, локализации или в ферментативной активности соответствующих белков, которые возникают в результате изменений нуклеотидных последовательностей ДНК. Эти проблемы более подробно освещены в следующих разделах книги.

Отметим только, что в  настоящее время подобные исследования стали возожны для многих сотен наследственных заболеваний человека, для которых идентифицированы геномные последовательности ДНК, соответствующие генам, и проклонированы пол-норазмерные кДНК-последовательности.

Раздел 6. Каталог генов  и генных болезней МакКьюсика. Международная программа "Геном человека".

Огромный вклад в систематизацию и обобщение информации о генетических картах хромосом человека, локализации  и функциях отдельных генов, и  о структуре генома в целом, вносят исследования, проводимые на протяжении последних 30 лет в Университете Джона Хопкинса в Балтиморе под руководством профессора Виктора МакКьюсика. Результатом этих исследований является систематическое, с 2-х-годичным интервалом между последними пятью публикациями, издание энциклопедий, содержащих сводные данные о всех картированных генах человека и связанных с ними наследственных болезнях под названием:"Менделевсое наследование у человека: каталог человеческих генов и генетических болезней" ("Mendelian inheritance in man. Catalogs of autosomal dominant, autosomal recessive,and X-linked phenotypes". Эти издания содержат современные хромоcомные карты генов человека и для каждого локуса обобщенные в виде отдельных статей сведения о характере наследования, функциях и размерах генов; методах их картирования и идентификации; кодируемых продуктах; мутантных аллелях, полиморфизмах и внутригенных повторах; фенотипических проявлениях мутаций, их связи с наследственными заболеваниями, а также о природе основного дефекта, включая патогенез и патофизиологию заболевания. Все статьи снабжены исчерпывающими литературными ссылками. Cводные таблицы по картированным локусам с различным типом наследования и по генам наследствен ных заболеваний составлены либо в соответствии с их хромосомной локализацией, либо в алфавитном порядке по названиям генов или по наименованиям соответствующих генных болезней. Отдельно представлены данные по клонированным генам,для которых известен первичный молекулярный дефект. При этом количество различных идентифицированных мутантных вариантов для разных генов колеблется от одного до нескольких сотен.