Оберемок В.В. Справочник по ДНК-модифицирующим энзимам и связанным с ними методам молекулярной генетики (на русском и английском языках)

    Министерство образования и науки Украины

Таврический национальный университет

имени В.И. Вернадского

кафедра экологии и рационального природопользования

В.В. Оберемок

Краткий справочник по ДНК-модифицирующим энзимам и связанным с ними методам молекулярной генетики

(на русском и английском языках)

Brief Reference Book on DNA Modifying Enzymes and Connected with them Methods of Molecular Genetics

(in Russian and in English)

для студентов 5 курса дневной формы обучения

специальности 8.070402

«биология»

образовательно-квалификационного уровня «магистр»

профессионального направления подготовки

0704 «биология»

и

для студентов 3 курса дневной формы обучения

направления подготовки 6.040101

«химия»

образовательно-квалификационного уровня «бакалавр»

профессионального направления подготовки

0401 «химия»

Симферополь   2010

Рекомендовано к печати заседанием кафедры экологии и рационального природопользования от 02.11.2010

протокол № 4

Рекомендовано к печати учебно-методическим советом ТНУ

от 07.10.2010

протокол № 1

СОДЕРЖАНИЕ

Вступление……………………………………………………4

ДНК-полимеразы……………...…………………………………5

-     Полимеразная цепная реакция………………………………..12

-      Секвенирование……………………………………………...13

Эндонуклеазы………………………………………………..........15

-    Рестриктазы…………………………………………………...17

-    Рестрикционный анализ………………………………………..22

Экзонуклеазы……………………………………………………23

ДНК-лигазы………………………………………………………..26

-     Лигазная цепная реакция……………………………………28

Технические данные…………………………………………......29

Список использованной литературы.……………………….58

CONTENTS                                                                           

Introduction…………………………………………………………4

DNA Polymerases…………………………………………….....33

-          Polymerase Chain Reaction………….………………………....39

-          DNA Sequencing…………………………………………….40

Endonuсleases……………………………………………………..42

-                Restriction Enzymes…………………………………………44

-          Restriction Analysis…………………………………………....48

Exonuсleases……………………………………………………49

DNA Ligases………………………………………………………51

-          Ligase Chain Reaction………………………………………53

Technical Data………………………………………………….....55

References……………………………………………………….58

Введение

Молекулярная генетика развивается настолько быстро, что требует от молодого ученого высокого уровня понимания явлений, происходящих в этой области, чтобы не заблудиться между мириадами фактов. Способность уловить основные идеи теории и методов молекулярной генетики является ценным качеством будущего специалиста, что позволяет ему чувствовать свободу при проведении экспериментов. Мы собрали и переработали информацию о ДНК-модифицирующих энзимах и связанных с ними методах, находящуюся на веб-сайтах, в научных статьях, книгах, справочниках и каталогах продукции для опытов в области молекулярной биологии, чтобы предложить на рассмотрение базовые знания по этой теме. Пример справочника на английском языке будет полезным для иностранных студентов и студентов, которые планируют продолжить свое образование за рубежом. Мы искренне надеемся, что студенты и молодые ученые с интересом будут читать предоставленный материал.

Introduction

Molecular genetics has been developing so fast that it requires high level of a young scientist’s understanding of events in that field to not get lost between myriads of facts. Ability to catch the core ideas of molecular genetics theory and methods is a valuable feature of a future specialist that allows him to feel freedom while conducting experiments. We collected and carried out the information about DNA modifying enzymes and connected with them methods been on web sites, in research papers, books, molecular biology catalogs and product application guides to provide the basic knowledge on this topic. The sample of reference book in English will be helpful for foreign students and students that are planning to continue their education abroad. We sincerely hope that students and young scientists will read the provided material with interest.

ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ

ДНК-полимераза I

ДНК-зависимая ДНК-полимераза, катализирует 5`→3` синтез ДНК. Фермент также обладает 3`→5` экзонуклеазной (корректура) активостью, 5`→3` экзонуклеазной активностью и свойствами рибонуклеазы Н.

Особенности:

1)       включает в себя модифицированные нуклеотиды (например, биотин-, дигоксигенин-, флуоресцентно меченые нуклеотиды);

2)       проявляет активность в буферах для ПЦР и рестриктаз.

Область применения:

1)       ДНК-маркирование ник-трансляции в сочетании с ДНКазой;

2)       синтез второй нити кДНК в сочетании с РНКазой H.

10Х Реакционный буфер

500 мМ Трис-HCl (рН 7,5 при 25 oС), 100 мМ MgCl2, 10 мМ ДТТ.

Ингибирование и инактивация

Ингибиторы: соединения, хелатирующие металлы; инактивация нагреванием при 75 oС в течение 10 мин или путем добавления ЭДТА.

Рис. 1. Схема активности ДНК-полимеразы I: I – синтез; II – 3`→5` экзонуклеазная активность; III – 5`→3` экзонуклеазная активность; a – ДНК-полимераза I; b – дезоксирибонуклеозид-5`- монофосфаты

Рис. 2. Структура ДНК-полимеразы I

*Интересные детали. Флуоресцеин – это синтетическое органическое соединение в виде темно-оранжевого/красного порошка, растворимого в воде и спирте. Он широко используется в качестве флуоресцентных меток для многих приложений. Флуоресцентно меченые нуклеотиды могут быть использованы в методике FISH (флуоресценция на месте гибридизации), или могут быть использованы в качестве мишени для антител при иммуногистохимических исследованиях.

*Лабораторная полка

ЭДТА–этилендиаминтетрауксусная

кислота. Она широко используется для растворения карбоната кальция. Её польза вытекает из возможности выступать в роли шестидентатного лиганда и хелатирующего агента, то есть её способности связывать ионы металлов, таких как Mg2+, Ca2 + и Fe3+.. Будучи связанными ЭДТА, ионы металлов остаются в растворе, но их реакционная  способность уменьшается.

Трис – трис-(оксиметил)-аминометан. Трис широко используется в биохимии и молекулярной биологии. Полезный диапазон буфера с трис (7-9) совпадает с рН большинства живых организмов. Этот признак и его низкая стоимость сделали трис одним из наиболее распространенных буферов, используемых в биологических и биохимических лабораториях.

ДТТ – дитиотрейтол. ДТТ используется в качестве восстановителя для тиолированной ДНК. Терминальные атомы серы тиолированного ДНК склонны к образованию димеров в растворе, особенно в присутствии кислорода. Димеризация значительно снижает эффективность последующих реакций соединения, таких как ДНК-иммобилизация на золоте в биосенсорах.

Фрагмент Кленова

Фрагмент Кленова – большой фрагмент ДНК-полимеразы I. Он обладает 5`→3` активностью полимеразы и 3`→5` экзонуклеазной (корректура) активностью, но не обладает 5`→3` экзонуклеазной активностью ДНК-полимеразы I.

Особенности:

1)              включает в цепь модифицированные нуклеотиды (например, биотин-, дигоксигенин-, флуоресцентно меченые нуклеотиды);

2)              активен в буферах для рестриктаз, ПЦР, T4 ДНК-лигаз.

Область применения:

1)       формирование тупых концов дцДНК путём заполнения

5`-свесов;

2)       ДНК-маркирование при помощи случайных праймеров;

3)       маркирование ДНК  путём заполнения 5`-свесов дцДНК;

4)       секвенирование ДНК методом Сенгера;

5)       сайт-специфический мутагенеза ДНК с использованием синтетических нуклеотидов;

6)       синтез второй цепи кДНК.

10Х Реакционный буфер

500 мМ Трис-HCl (рН 8,0 при 25 oС), 50 мМ MgCl2, 10 мМ ДТТ.

Ингибирование и инактивация

Ингибиторы: хелатирующие агенты; инактивация нагреванием при 75 oС в течение 10 мин или путем добавления ЭДТА. Для фрагмента Кленова, как и для ДНК-полимеразы I, необходимы:

1) ДНК-матрица;

2) праймеры;

3) свободный 3`-ОН конец;

4) дезоксинуклеозидтрифосфаты.

* Интересные детали. Фрагмент Кленова, как и ДНК-полимераза I, катализирует включение дНТФ со скоростью приблизительно 20 нт/сек.

Т7 ДНК-полимераза

ДНК-зависимая ДНК-полимераза, катализирует синтез ДНК в 5`→3` направлении. Высокопроцессивная ДНК-полимераза, которая позволяет синтезировать длинные фрагменты ДНК. Фермент также обладает высокой 3`→5` экзонуклеазной активностью по отношению к одно- и двухцепочечной ДНК.

Особенности:

1)       сильная 3`→5` экзонуклеазная активность;

2)       активна в буферах для рестрикционных энзимов.

Область применения:

1)       очистка ковалентно связанных кольцевых ДНК от остаточной геномной ДНК;

2)       удлинение праймеров на длинных матрицах ДНК;

3)       ДНК-маркирование 3`-конца;

4)       удлинение цепи при изучении сайт-направленного мутагенеза;

5)       заполнение 5`-свесов дцДНК;

6)       синтез второй цепи кДНК;

7)       in situ обнаружение фрагментированной ДНК, связанной с апоптозом.

10X Реакционный буфер

400 мМ Трис-HCl (рН 7,5 при 25 oС), 100 мМ MgCl2, 10 мМ ДTT.

Ингибирование и инактивация

Ингибиторы: хелатирующие агенты, модифицирующие реагенты (уксусный ангидрид, N-этилмалеимид инактивируют 3`→5` экзонуклеазную активность, но не полимеразную активность); инактивация нагреванием при 75 oС в течение 10 мин.

Pfu ДНК-полимераза

Термостабильный фермент с массой примерно 90 кДа, изолированный из бактерии Pyrococcus furiosus. Фермент катализирует полимеризацию нуклеотидов при формировании второй цепи ДНК при 75oC в направлении 5'→ 3' в присутствии ионов магния. Pfu ДНК-полимераза обладает 3'→5' экзонуклеазной (корректура) активностью.

Особенности:

1)       ошибки вставки азотистых оснований, которые могут возникнуть в процессе полимеризации, быстро исправляются  полимеразой;

2)       проявляет активность в буферах для рестриктаз;

3)       фрагменты ДНК, генерируемые Pfu ДНК-полимеразой, имеют тупые концы.

Область применения:

1)       секвенирование;

2)       удлинение праймеров.

10 X Реакционный буфер

200 мМ Трис-HCl (рН 8,8), 20 мМ MgSO4, 100 мМ KCl, 100 мМ (NH4)2SO4,1% Тритона Х-100, 1 мг / мл нуклеазы без БСА.

Ингибирование и инактивация

Ингибиторы: ЭДТА, хелатирующие агенты.

*Лабораторная полка

Тритон Х-100 – полиэтиленгликоля моно (тетраметилбутанол)фениловый эфир. Представитель неионных ПАВ. Используется при выделении ДНК в составе лизирующего раствора. Это соединение разрушает вторичные связи в белках.

* Интересные детали. Pfu ДНК-полимераза меньше всего делает ошибок при синтезе цепи, чем любая другая термостабильная полимераза; скорость синтеза – 2000 н/мин.

Taq ДНК-полимераза

Катализирует включение дНТФ в ДНК. Она требует наличие ДНК-матрицы, праймера, и катионов Mg2+..Taq ДНК полимераза обладает зависимой от полимеризации 5'→3' экзонуклеазной активностью. Она не обладает 3`→5' экзонуклеазной активностью и таким образом не имеет корректирующей функции. Несмотря на это, фермент синтезирует ДНК в пробирке с приемлемой точностью.

Особенности:

1)       сильная 5`→3` экзонуклеазная активность;

2)       30% продуктов амплификации имеют аденозин-5`-монофосфатные свесы;

3)       активна в буферах для рестриктаз.

Область применения:

1)       ПЦР. Taq-полимераза стабильна вплоть до 95 °C (фермент выделен из теплолюбивой бактерии Thermus aquaticus), поэтому нет необходимости добавлять фермент при проведении 35 циклов ПЦР. Максимальная активность фермента находится между 70-75 ° С, что сводит к минимуму явление образования вторичной структуры ДНК и приводит к высокому выходу реакции полимеризации. Режимы отжига праймеров можно выбирать от 30 до 70 °C.;

2)       Циклическое секвенирование. Этот фермент дает более равномерные полосы, чем фрагмент Кленова. Высокий температурный интервал и циклический режим позволяют секвенировать трудные последовательности (шпильки) с большим успехом. Он может секвенировать гомополимерные последовательности лучше, чем фрагмент Кленова.

Реакционный буфер

Фермент может быть разбавлен в 10 мМ Трис (рН 7,6), 0,5 мг/мл БСА, 0,1 мМ ДТТ, 0,1 мМ ЭДТА. Используйте раствор с ферментом в тот же день.

Ингибирование и инактивация

Ингибиторы: бромфеноловый синий, мочевина, ДМСО, формамид и ДСН в некоторой степени тормозят Taq (ксиленцианол, (0,02%) не ингибирует этот фермент). Taq ингибируется на 47% при 10% концентрации ДМСО. Даже в этом случае полимераза может быть использована для ПЦР и циклического секвенирования ГЦ-богатых участков ДНК в присутствии 10% ДМСО, если количество Taq увеличить в два раза.

Типичная реакционная смесь для ПЦР:

1)       5хПЦР-буфер – 5 мкл;

2)       MgSO4, 50 мM – 1,5 мкл;

3)       H2O (дистиллированная) – 3 мкл;

4)       дНТФ-микс, 2 мM – 2,5 мкл;

5)       Taq-буфер, 5 ед/мкл – 0,5 мкл;

6)       минеральное масло – 10,5 мкл;

7)       2 праймера, 3,3 ОЕ/мл – по 1 мкл;

8)       ТЕ-буфер с ДНК – 5 мкл.

*Лабораторная полка

Формамид – это прозрачная жидкость, которая смешивается с водой и обладает аммиачным запахом. В чистом виде, он растворяет многие ионные соединения, которые не растворяются в воде, поэтому формамид используется также как растворитель. Формамид используется в качестве стабилизатора РНК в геле путём деионизации РНК. В капиллярном электрофорезе он используется для стабилизации одноцепочечных нитей денатурированной ДНК.

ДМСО – диметилсульфоксид. Это бесцветная жидкость является важным полярным апротонным растворителем, который растворяет как полярные, так и неполярные соединения и смешивается с широким спектром органических растворителей, а также с водой. Обладает характерным свойством проникать в кожу очень легко, так что можно почувствовать его вкус вскоре после его контакта с кожей. Вкус ДМСО напоминает вкус устриц или чеснока. ДМСО используется в ПЦР для подавления образования вторичной структуры матричной ДНК или ДНК праймеров. Она добавляется к ПЦР смеси до проведения реакции, где она мешает одноцепочечным цепям ДНК комплементарно взаимодействовать между собой, сводя к минимуму этот нежелательнй фактор.

ДСН – додецилсульфат натрия. Он может быть использован для лизиса клеток во время экстракции ДНК и для распутывания белков. SDS обычно используется при подготовке белков к электрофорезу. Это соединение работает, разрушая нековалентные связи в белках, денатурируя их и заставляя молекулы потерять свою нативную конформацию. Кроме того, анионы ДСН присоединяются к основной цепи пептида в соотношении один анион ДСН для любых двух аминокислотных остатков. Это эффективно придает отрицательный заряд белку, который пропорционален массе белка (около 1,4 г ДСН/ 1 г белка).

БСA – бычий сывороточный альбумин. БСА используется для стабилизации некоторых ферментов во время рестрикции ДНК и для предотвращения слипания фермента в реакционных пробирках. Этот белок не влияет на другие ферменты, которые не нужны для стабилизации. БСA также широко используется для определения количества других белков при сравнивании неизвестного количества белка с известным количеством БСА.

Полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция является методом быстрого "клонирования" определенной части ДНК в пробирке в течение 30-40 циклов.

Полимеразная цепная реакция была изобретена американским биохимиком Кэри Мюллисом в 1983 году. Широкий уровень возможностей, дешевизна и простота ПЦР позволили этому методу найти применение в различных областях генетических исследований. В основе ПЦР лежит естественный процесс клеточной репликации.

Каждый цикл состоит из трех этапов: денатурация, отжиг праймеров, синтез ДНК. Для каждого шага существует специальный температурный и временной интервал:

1) денатурация (94 °С, 0.5-1 мин);

2) отжиг праймеров (35-65 °С, 0.5-1 мин);

3) синтез (72 oС, 0.5-1 мин).

Аккуратное выделение ДНК, амплификация ДНК, и детекция продуктов амплификации (электрофорез) обеспечивают высокое качество полимеразной цепной реакции. Количество ампликонов фрагмента ДНК из одной клетки, образованных во время ПЦР, может быть найдено по следующей формуле: F = 2n, n-число циклов.

Рис. 3.Схема ПЦР: I, II, III, – 1-й, 2-ой и 3-ий циклы; 0 – фрагмент целевой ДНК; a – денатурация; b – отжиг праймеров; c – синтез

ДНК-секвенирование

Метод определения порядка нуклеотидных оснований в ДНК-мишени. Этот метод был изобретен британским ученым Фридериком Сенгером в 1975. В качестве матрицы при ДНК-секвенировании используется одноцепочечная ДНК. Для инициации секвенирования ДНК ДНК-полимеразой используются синтетические праймеры или природные субфрагменты, полученные при помощи рестриктаз. 3'-конец праймера должен заканчиваться перед участком ДНК, который будет секвенироваться.

Рис. 4. Схема секвенирования ДНК

Для выяснения последовательности нуклеотидов в целевой части ДНК, проводят 4 полимеразные реакции. В каждую из четырех смесей реакции обязательно нужно добавить дезоксинуклеозид- трифосфаты (дЦТФ, дГТФ, дТТФ, дАТФ) и ДНК-полимеразу. Кроме этого, в каждую из пробирок добавляют один из дидезоксинуклеозидтрифосфатов (ддЦТФ, ддГТФ, ддТТФ и ддАТФ). ддНТФ в 3'-положении, вместо гидроксильной группы (ОН) содержит водород (Н). ddНТФ принимает участие в реакции полимеризации ДНК и сразу прекращает её. В каждой реакционной смеси соотношение между дЦТФ, дГТФ, дТТФ, дАТФ и одним из ддНТФ составляет 100:1. Из-за низкой концентрации ддНТФ реакция не заканчивается в начале секвенирования ДНК. В то же время реакционная смесь будет содержать большое количество фрагментов ДНК различной длины (из-за присоединения ддНТФ в различных точках растущей нити ДНК).

С помощью электрофореза продукты полимеризации ДНК разделяют и получают последовательность целевой ДНК.

ЭНДОНУКЛЕАЗЫ

ДНКаза I

Эта эндонуклеаза разрезает одно- и двухцепочечную ДНК. Она гидролизует фосфодиэфирные связи, образовывая моно- и олигодезоксирибонуклеотиды с 3'-ОН и 5`-фосфатными концами.

Особенности:

1)       активность фермента строго зависит от ионов Са2+ и активируется ионами Mg2+ или Mn2+;

2)       в присутствии Mg 2+, ДНКаза I расщепляет каждую нить дцДНК по отдельности случайным образом;

3)       в присутствии ионов Mn2+ фермент расщепляет обе цепи ДНК примерно в том же месте, образовывая фрагменты ДНК с тупыми концами или со свесами длиной в один-два нуклеотида;

4)       ДНКаза чувствительна к физической денатурации, поэтому перемешивайте фермент мягко, не встряхивайте.

Область применения:

1)       подготовка раствора с РНК, не содержащего ДНК;

2)       удаление матрицы ДНК в пробирке перед транскрипцией in vitro;

3)       подготовка раствора с РНК, не содержащего ДНК перед ОТ-ПЦР;

4)       ДНК-маркирование методом ник-трансляции при содействии ДНК-полимеразы;

5)       исследования ДНК-белковых взаимодействий с ДНКазой;

6)       создание библиотек случайно перекрывающихся инсерций ДНК. Используется реакционный буфер, содержащий Mn2+.

10X Реакционный буфер с MgCl2

100 мМ Трис-HCl (рН 7,5 при 25 ° С), 25 мМ MgCl2, 1 мМ CaCl2.

10X Реакционный буфер с MnCl2

100 мМ Трис-HCl (рН 7,5 при 25 °С, 1 мМ CaCl2). Рекомендуемая концентрация MnCl2 в 1X реакционном буфере составляет 10 мM.

Ингибирование и инактивация

Ингибиторы: хелатирующие агенты, переходные металлы (например, Zn) в милимолярных концентрациях, ДСН (даже в концентрациях менее 0,1%), восстановители (ДТТ), ионная сила выше 50-100 мM; инактивируется нагреванием при температуре 65 °С в течение 10 минут в присутствии ЭДТА (используется по крайней мере 1 моль ЭДТА на 1 моль Mg 2+/Mn2+).

Рис. 5. Активность ДНКазы I в присутствии Mg2+ или Mn2+

Эндонуклеаза IV, E. coli (Endо 4)

Эндонуклеаза IV узнаёт апуриновые/апиримидиновые (AP) участки двухцепочечной ДНК и расщепляет фосфодиэфирную связь, образуя гидроксильные группы на 3`-конце. Эндонуклеаза может действовать как эстераза, отщепляя 3`-фосфогликолат и 3`-фосфат c повреждённых концов двухцепочечной ДНК. Эндонуклеаза IV обладает также 3`→5` экзонуклеазной активностью.

Особенности:

1)       её активность на субстрате чувствительна к ионной силе, ионам металлов, ЭДТА, а также к восстановителям;

2)       субстраты с удаленными 3`- концами являются преимущественно субстратами для 3`→5`экзонуклеазной активности;

3)       фермент не требует наличия Mg2+, но более активен в его присутствии.

Область применения:

1)       изучение повреждений ДНК и её репарацию;

2)       электрофорез одной клетки;

3)       исследования противоопухолевых препаратов;

4)       исследования структуры ДНК;

5)       анализ одиночного нуклеотидного полиморфизма (ОНП).

10Х Реакционный буфер

100 мМ Трис-HCl (рН 8,5 при 25 °С), 25 мМ MgCl2.

Ингибирование и инактивация

Ингибиторы: фермент довольно устойчив к ЭДТА в ходе реакции, но становится чувствительным даже к субмилимолярным количествам хелатирующих агентов, когда нет матрицы ДНК; инактивируется нагреванием при 80 °С в течение 15 мин.

Рис. 6. Активность эндонуклеазы IV

Рестриктазы

Рестриктазы распознают определенные нуклеотидные последовательности и расщепляют молекулы ДНК внутри или за пределами узнаваемого ими сайта. Расщепление приводит к дегенерации ДНК с образованием "липких" (5`- или 3`-свесов) или "тупых" концов.

Общие свойства

Явление специфичности действия рестриктаз была впервые обнаружена Лурия и Хьюманом в начале 1950-х. Почти десять лет спустя, Арбер и Дюссо предсказали молекулярные основы специфичности действия рестриктаз. Они предположили, что специфичность заключается в функционировании двухферментной системы: рестриктазы, которая узнает специфические последовательности ДНК и расщепляет чужеродную ДНК при ее попадании в бактериальную клетку и модифицирующего фермента (метилтрансферазы), который защищает ДНК хозяина от деградации собственной рестриктазой. Оба фермента узнают один и тот же сайт и вместе образуют систему рестрикции-модификации (Р-М).

Системы рестрикции-модификации широко распространены среди бактерий, а также были изолированы из фага, архей и вирусов эукариотических водорослей. Р-М системы были разделены на четыре типа (I, II, III и IV) в зависимости от сложности их структуры, требований кофактора, механизма действия и последовательности расщепляемого сайта. Лучше всего охарактеризованы и чаще всего используются рестриктазы II типа. Эти ферменты распознают определенные последовательности ДНК длиной 4-8 п.о. и расщепляют ДНК либо в сайте узнавания, либо на расстоянии до 20 пар оснований от сайта узнавания.

Нередко бывает, что более чем один фермент узнаёт определенную последовательность нуклеотидов. Исходя из номенклатуры рестриктаз, фермент с уникальной специфичностью расщепления ДНК, который был обнаружен первым, называется прототипом. Впоследствии обнаруженные ферменты, обладающие той же специфичностью, называются изошизомерами. Изошизомеры могут отличаться от прототипа по уровню способности расщеплять целевой сайт, условий реакции, а также чувствительности к метилированию и спобности к звёздчатой активности. Рестриктазы, которые признают ту же последовательность нуклеотидов, но расщепляют ДНК в разных местах называются неошизомерами.

Выбор сайтов рестриктазами

В 1975 году Томас и Дэвис обнаружил, что EcoRI расщепляет ДНК фага в пяти сайтах узнавания с разной степенью интенсивности, которая может различаться на порядок. Подобные примеры были зарегистрированы и для других ферментов рестрикции. Такие факторы, как фланкирующие последовательности, метилированная ДНК и число сайтов расщепления, по всей видимости, влияют на эффективность расщепления. Расщепление устойчивых сайтов может быть существенно улучшено с помощью добавления хорошо расщепляемой ДНК и олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих сайт узнавания, или спермидин.

Типы рестриктаз:

1) ферменты I-го типа расщепляют ДНК на участках, удаленных от сайта узнавания; требуют как АТФ, так и S-аденозил-L-метионин для функционирования; многофункциональный белок, способный как к рестрикции, так и к метилированию;

2) ферменты II типа расщепляют ДНК в пределах или на малых расстояниях от конкретного сайта узнавания, большинству необходим магний; ферменты, обладающие одной функцией (рестрикционной), не способны к метилированию;

3) ферменты III типа расщепляют ДНК в местах недалеко от сайта узнавания; требуют наличия АТФ (но не её гидролиз), S-аденозил-L-метионин стимулирует реакции, но не является обязательным; существует как часть комплекса, включающего метилазу;

4) ферменты IV типа расщепляют метилированную ДНК.

Звездчатая активность

Рестриктазы узнают определенные нуклеотидные последовательности в молекулах ДНК. Однако их сайт-специфическое узнавание может быть уменьшено in vitro. При определенных условиях ферменты могут распознавать и расщеплять нуклеотидные последовательности, которые отличаются от канонического сайта. При низкой ионной силе, например BamHI (с сайтом узнавания GGATCC) способна расщеплять следующие последовательности: NGATCC, GPuATCC и GGNTCC. Это явление называется «звёздчатой активностью». Для большинства случаев использования рестриктаз звёздчатая активность не является желательной.

Звездчатая активность является результатом:

1) длительной инкубации (сверхрасщепление);

2) высокая концентрация фермента в реакционной смеси;

3) высокая концентрация глицерина в реакционной смеси;

4) наличие в реакционной смеси органических растворителей, таких как этанол, диметилсульфоксид (ДМСО) или диметилформамид (ДМФА);

5) низкая ионная сила реакции буфера;

6) субоптимальное значение рН реакционного буфера;

7) замена Mg2+ другими двухвалентными катионами, такими, как Mn2+ или Co 2+.

В некоторых случаях, продукты ДНК, образованные в ходе расщепления рестриктазой канонического сайта, стимулируют звёздчатую активность фермента.

Недостаточное расщепление ДНК и звёздчатая активность приводят к атипичным электрофореграммам, по которым при кропотливом изучении эти два явления можно различить.

Различия между звездчатой активностью и неполным расщеплением

Звёздчатая активность приводит к появлению дополнительных полос ДНК под ожидаемыми полосами и отсутствию каких либо полос над самым длинным ожидаемым фрагментом ДНК. Эти полосы становятся более отчётливыми, в то время как ожидаемые полосы становятся менее отчётливыми, если время инкубации или количество фермента увеличить.

Неполное расщепление ДНК приводит к пояалению дополнительных полос, расположенных выше ожидаемых фрагментов. Дополнительные полосы исчезают, когда время инкубации или количество фермента увеличивается. Никаких дополнительных полос ниже наименьшего ожидаемого фрагмента не наблюдается.

Некоторые рестриктазы (например, Alol, Taul, EcoRII) остаются связанными с матрицей ДНК после расщепления и вызывают изменения в подвижности продуктов рестрикции во время электрофореза. В этих случаях добавляют ДСН, раствор нагревают в течение 10 мин при 65 °С и остужают на льду перед загрузкой в гель.

Расщепление метилированной ДНК

Метилирование ДНК – это процесс переноса метилтрансферазой метильной группы от молекулы донора к молекуле цитозина или аденина. Такого типа метилирование является наиболее распространенным процессом модификации ДНК в живых организмах. Преимущественно три типа метилированных оснований найдены в ДНК: 1) 5`-метилцитозин (5mC); 2) N4-метилцитозин (m4C); 3) N6-метиладенин (m6A).

У прокариот, расщепление ДНК родственными ферментами предупреждено метилированием ДНК сайт-специфическими метилтрансферазами, которые являются неотъемлемой частью каждой системы рестрикции-модификации. Большинство штаммов кишечной палочки используемые для размножения плазмидной ДНК содержат две сайт-специфические ДНК-метилтрансферазы – Dam и Dcm. Метилаза, кодируемая геном dam метилирует N6-положение аденина с последовательностью GATC. Метилаза, кодируемая геном dcm, метилирует С5-положения внутреннего остатка цитозина в последовательности CCWGG.

ДНК высших эукариотических организмов обладает остатками 5-метилцитозина в CpG или CpNpG контекстах. Эти тканеспецифические признаки наследуемы. Они участвуют в регуляции экспрессии генов и клеточной дифференциации.

В случаях, когда целевой сайт рестрикции перекрывается с метилированным сайтом, следующие результаты расщепления возможны: 1) не влияет; 2) частичное торможение, 3) полная блокада.

Для достижения эффективного расщепления ДНК, необходимо принимать во внимание и тип метилированной ДНК и чувствительность рестриктазы к метилированной ДНК.

Однобуквенный код (для описания сайтов рестриктаз)

R = G или A; Y = C или T; W = A или Т; М = А или C; K = G или T; S = C или G; H = A, C или T; V = A, C или G; B = C, G или T; D = A, G или Т; N = G, A, T и C; (A, T, G, С - азотистые основания).

Примеры ферментов рестрикции

              Alul

Dam, Dcm, CpG - нет эффекта. Инактивируется нагреванием в течение 20 мин при температуре 65 оС. Необходимо наличие как минимум 4 п.о. с конца ДНК для полного её расщепления. Оптимальная температура инкубации – 37 °С.

*Интересные детали. Как правило рестриктазы активны в буферах для ПЦР.

XceI (NspI)

Dam, Dcm, CpG - нет эффекта. Инактивируется нагреванием в течение 20 мин при температуре 65 оС. Оптимальная температура инкубации – 37 °С.

Tail (MaeII)

Для обеспечения эффективности расщепления реакцию проводят под керосином. Оптимальная температура работы фермента – 65 оС. Если метилирование происходит в CpG, то сайт расщепления блокируется ("CpG" это сокращение для "-Ц-фосфат-Г-", то есть, цитозин и гуанин, разделенные фосфатом, который связывает два нуклеозида вместе в ДНК). Не инактивируется нагреванием. 2 п.о. с конца ДНК необходимы для полного её расщепления. Оптимальная температура инкубации составляет 65 оС.

*Интересные детали. Смит, Уилкокс и Келли, работая в Университете Джона Хопкинса, в 1968 году выделили и охарактеризовали первую рестриктазу, функционирование которой зависела от конкретной нуклеотидной последовательности ДНК. Работая с бактерией Haemophyllus influenzae, эта группа учёных изолировала фермент, называемый HindII, который всегда расщепляет молекулы ДНК в определенном сайте, состоящем из шести пар оснований в пределах определенной последовательности шести пар основаниий:

5 'GT (T или C) (A или G) AC 3 "

3 'CA (A или G) (T или C) TG 5'

Они обнаружили, что фермент HindII всегда расщепляет последовательность ДНК непосредственно в центре этой последовательности. Везде, где встречается эта последовательность из шести пар оснований, HindII будет расщеплять обе цепи ДНК между 3 и 4 парами оснований последовательности.

              Рестрикционный анализ

Этот метод основан на способности ферментов рестрикции специфически расщеплять ДНК в определённых сайтах.

Рис. 7. Схема рестрикционного анализа

Если происходит изменение в сайте узнавания (мутация, рекомбинация, метилирование ДНК и т.д.) рестриктаза теряет способность выполнять свою функцию. Основная идея заключается в следующем: различные последовательности ДНК приводят к расщеплению ДНК ферментами рестрикции в разных местах. Полученные с помощью рестриктаз фрагменты ДНК служат маркерами различных процессов, происходящих внутри клетки исследуемого организма.

*Лабораторная полка

ПЭГ – полиэтиленгликоль. ПЭГ используется в ряде зубных паст как диспергатор. ПЭГ обычно используются в качестве преципитанта для изолярования ДНК плазмиды и кристаллизации белка. В случае присоединения к различным препаратам на основе белка полиэтиленгликоль позволяет замедлить очистку крови от такого белка. Он замещает воду в деревянных объектах, что делает древесину прочной и препятствует деформации и сжатию древесины, когда она высохнет. В области микробиологии, ПЭГ-преципитация используетсяся для концентрирования вирусов.

Вода – никакого чая вечером без неё.

ЭКЗОНУКЛЕАЗЫ

Экзонуклеаза I (Exo I)

Экзонуклеаза I (ExoI) разрушает одноцепочечные ДНК в 3`→5` направлении, высвобождая дезоксирибонуклеозид-5`-монофосфаты.

Особенности:

1)       её активность на субстрате чувствительна к ионной силе, ионам металлов, ЭДТА, а также к восстановителям;

2)       не расщепляет двухцепочечные нити ДНК с 3`-ОН-концами, заблокированными фосфорильными или ацетильными группами;

3)       активна в буферах для ПЦР;

4)       не подходит для удаления 3 `-свесов из дцДНК.

Область применения:

1)       удаление праймера из ПЦР-смеси;

2)       удаление одноцепочечной ДНК, содержащей 3 `-гидроксильные концы из смесей нуклеиновых кислот;

3)       анализ на наличие одноцепочечной ДНК с 3`-гидроксильным концом.

10Х Реакционный буфер

670 мM глицин-КОН (рН 9,5 при 25 °С), 67 мМ MgCl2, 10 мМ DTT.

Ингибирование и инактивация

Ингибиторы: 20% (вес/объём) ПЭГ 8000; инактивация нагреванием при 80 °С в течение 15 мин.

Рис. 8. Активность экзонуклеазы I
 

Экзонуклеаза III

Экзонуклеаза III (Exo III) катализирует четыре типа реакций:

1) 3`→5` экзодезоксирибонуклеазная активность только на двухцепочечной матрице ДНК: Exo III разрушает дцДНК с тупых концов, 5 `-свесов или ников (брешей), высвобождая 5`-мононуклеотиды от 3`-концов ДНК и производя протяженные участки одноцепочечной ДНК. Она не активна на 3`-свесах ДНК, которые по крайней мере имеют длину в четыре основания и не несут 3`-терминальный C-остаток на одноцепочечной ДНК;

2) фосфатазная активность: Exo III удаляет 3`-терминальный фосфат и генерирует 3`-ОН-группу;

3) активность РНКазы Н: Exo III экзонуклеолитически разрушает цепь РНК в РНК/ДНК гибридах;

4) имеет апуриновую/апиримидиновую эндонуклеазную активность: Exo III расщепляет фосфодиэфирные связи в апуриновых или апиримидиновых сайтах, образовывая 5`-концы, которые содержат дезоксирибоза-5`-фосфатные остатки, не имеющие азотистые основания.

Особенности:

1)       скорость расщепления ExoIII ДНК зависит от температуры, концентрации солей и молярного соотношения ДНК и фермента в реакционной смеси;

2)       оптимальные условия реакции должны быть определены экспериментально.

Область применения:

1)       создание однонаправленных делеций в фрагментов ДНК в сочетании с S1 нуклеазой;

2)       создание одноцепочечной матрицы ДНК для дидезоксисеквенирования;

3)       сайт-направленный мутагенез;

4)       клонирование продуктов ПЦР;

5)       приготовление цепь-специфических зондов.

10Х Реакционный буфер

660 мМ Трис-HCl (рН 8,0 при 30 °С), 6,6 мМ MgCl2.

Ингибирование и инактивация

Ингибиторы: хелатирующие агенты, р-хлорортутный бензоат (50-90% ингибирования при 0,1 мM); инактивируется нагреванием при 70 °С в течение 10 мин.

Рис. 9. Активность экзонуклеазы II

ДНК-ЛИГАЗЫ

Т4 ДНК-лигаза             

Катализирует образование фосфодиэфирных связей между расположенными вблизи 5`-фосфатного и 3`-гидроксильного концов в двухцепочечных молекулах ДНК или РНК. Фермент ремонтирует ники (бреши) однонитевых цепей ДНК в двухцепочечных молекулах ДНК, РНК или ДНК/РНК гибридах, соединяет фрагменты ДНК как с липкими, так и тупыми концами. Т4 ДНК-лигазе необходим АТФ в качестве кофактора.

Особенности:

1)       быстродействующая – лигирование липких концов происходит в течение 10 минут при комнатной температуре;

2)       фермент активен в буферах для рестриктаз, ПЦР и ОТ-ПЦР (при добавлении АТФ);

3)       ПЭГ обеспечивает эффективное лигирование тупых концов.

Область применения:

1)       клонирование продуктов рестрикции;

2)       клонирование продуктов ПЦР;

3)       присоединение двухцепочечных олигонуклеотидных линкеров или адаптеров к ДНК;

4)       сайт-направленный мутагенез;

5)       полиморфизм длин амплифицированных фрагментов (ПДАФ);

6)       лигаза-опосредованное обнаружение РНК;

7)       сшивание брешей в двухцепочечных ДНК, РНК или ДНК/РНК гибридах;

8)       самостоятельное закольцовывание линейных ДНК.

10X T4 ДНК-лигазный буфер

400 мМ Трис-HCl (рН 7,8 при 25 °С), 100 мМ MgCl2, 100 мМ ДТТ, 5 мМ АТФ.

Ингибирование и инактивация

Ингибиторы: сильно ингибируется NaCl или KCl при концентрациях > 200 мM; инактивируется нагреванием при 65 °С в течение 10 мин или при 70 °С в течение 5 мин.

* Интересные детали. Полиэтиленгликоль (ПЭГ) значительно увеличивает скорость лигирования ДНК с тупыми концами, молекулярная масса – 55,3 кДа.

Taq ДНК-лигаза

Катализирует образование фосфодиэфирных связей между расположенными вблизи 5`-фосфатного и 3`-гидроксильного концов в двухцепочечных молекулах ДНК или РНК. Лигирование будет происходить только тогда, когда олигонуклеотиды идеально подобраны к ДНК-мишени и не имеют никаких пробелов между ними, поэтому замена даже одного азотистого основания может быть обнаружена. Taq-ДНК-лигаза активна при повышенной температуре (45 °C – 65 °С).

Особенности:

1)       Taq ДНК-лигаза не является заменой для Т4 ДНК-лигазы;

2)       включает в ДНК фосфорилированные олигонуклеотиды во время ПЦР и лигазной цепной реакции.

Область применения:

1)       аллель-специфическое обнаружение гена с использованием лигазной детектирующей реакции и лигазной цепной реакции;

2)       мутагенез путем включения фосфорилированных олигонуклеотидов во время амплификации процесса удлинения праймера.

1X Taq ДНК-лигазный буфер

20 мМ Трис-HCl, 25 мМ ацетат калия, 10 мМ ацетат магния, 1 мМ НАД, 10 мМ дитиотреитола; 0,1% Тритона Х-100 (рН 7,6 при 25 °С).

Ингибирование и инактивация

Устойчивость Taq ДНК- лигазы при 95 °С: 0 мин – 64000 ед/мл, 15 мин – 32000 ед/мл, 60 мин – 16000 ед/мл.

Рис. 10. Активность Taq ДНК-лигазы

Лигазная цепная реакция

Техника амплификации ДНК, основанная на лигировании олигонуклеотидных зондов.

Рис. 11. Схема лигазной цепной реакции

Зонды предназначены для того, чтобы точно соединить две прилегающие последовательности целевой ДНК. Цепная реакция повторяется в три этапа в присутствии избытка зондов: (1) тепловая денатурация двухцепочечной ДНК, (2) отжиг зондов (праймеров) на ДНК-мишени, и (3) присоединение зондов термостабильной ДНК-лигазой. После того как реакция повторяется в течение 20-30 циклов, измеряется количество лигированных зондов.

В аллель-специфической ЛЦР используют четыре олигонуклеотида: два смежных олигонуклеотида, которые уникально соединяются с одной цепью ДНК-мишени и дополнительная пара смежных олигонуклеотидов, которые гибридизируются с противоположной цепью. Лигированные олигонуклеотиды с одного цикла служат матрицей во время следующих циклов.

Технические данные

Рис. I. Азотистые основания ДНК

Таблица I. Диапазон эффективного разделения фрагментов ДНК в агарозном геле

Таблица II. Общие физические константы

*Пересчёт концентрации олигонуклеотидов

Молекулярная масса:

MW =333xN

Концентрация олигонуклеотидов:

C (µM/ или пмоль/мкл) = A260/0.01xN;

C (нг/мл) = A260xMW/0.01xN;

MW – молекулярная масса, A260 – поглощение при 260 нм, N – число оснований

*ДНК/белок пересчёт

1 кб ДНК= 333 аминокислоты = 37 кДа

*Температура плавления двухцепочечной ДНК и олигонуклеотидов

Для олигонуклеотидов короче, чем 25 п.о., “Правило Уоллеса ”

Tm(в oC) = 2(A+Т) + 4(Г+Ц), где

(A+Т) – сумма адениновых и тиминовых оснований в олигонуклеотиде, а (Г+Ц) – сумма гуаниновых и цитозиновых оснований в олигонуклеотиде.

Для двухцепочечной ДНК < 100 п.о. длиной

Tm (в oC) = 81.5 oC+16.6 (log10[Na+])+0.41(%[Г+Ц]) –675/n –1.0m, где

n – число оснований в олигонуклеотиде;

m – процент несоединенных водородной связью пар оснований

*Часто используемые буферные растворы

1 M Трис-HCl [трис(гидроксиметил) аминометан]:

Доведите до желаемого pH концетрированной HCl.

Смешайте и доведите H2O до литра

1X TБЕ (Трис-боратный-ЭДТА) буфер для электрофореза:

1X TE (Tрис-ЭДТА) буфер, pH 7.4, 7.6 или 8.0, на литр:

*Выражение концентраций реагентов

Молярность

M (моль/л) = число молей растворённого вещества/число литров раствора

Концентрация

Концентрация, С (%) = вес растворённого вещества (г)x100%/общий вес раствора (г)

Ионная сила

Ионная сила, I, раствора – это функция от концентрации всех ионов, присутствующих в растворе, где ci – молярная концентрация иона i (моль·дм-3), zi – заряд данного иона; суммируются все ионы в растворе.

Таблица III. Размеры геномов

Таблица IV. Атомные числа и молекулярные массы некоторых химических элементов

Атомная масса– г/моль

DNA POLYMERASES

DNA polymerase I

              A template-dependent DNA polymerase, catalyzes 5`→3` synthesis of DNA. The enzyme also exhibits 3`→5` exonuclease (proofreading) activity, 5`→3` exonuclease activity and ribonuclease H activity.

Features:

1)       incorporates modified nucleotides (e.g., biotin-, digoxigenin-, fluorescently-labeled nucleotides);

2)       active in buffers for restriction enzymes, PCR.

Applications:

1)        DNA  labeling by nick-translation in conjunction with DNase;

2)        second-strand synthesis of cDNA in conjunction with RNase H.

10X Reaction buffer

500 mM Tris-HCl (pH 7.5 at 25 oС), 100 mM MgCl2, 10 mM DTT.

Inhibition and inactivation

Inhibitors: metal chelators; inactivated by heating at 75 oС for 10 min or by addition of EDTA.

Fig. 1. Scheme of DNA polymerase I activity: I – synthesis; II – 3`→5` exonuclease activity; III – 5`→3` exonuclease activity; a – DNA-polymerase I; b – deoxyribonucleoside monophosphates

Fig. 2. Structure of DNA Polymerase I

* Interesting details. Fluorescein is a synthetic organic compound available as a dark orange/red powder soluble in water and alcohol. It is widely used as a fluorescent tracer for many applications. Fluorescein-labelled nucleotides can be imaged using FISH (fluorescence in situ hybridisation), or targeted by antibodies using immunohistochemistry.

*Lab Shelf

EDTA – ethylenediaminetetraacetic acid. It is widely used to dissolve scale. Its usefulness arises because of its role as a hexadentate ("six-toothed") ligand and chelating agent, i.e. its ability to "sequester" metal ions such as Mg2+,Ca2+ and Fe3+. After being bound by EDTA, metal ions remain in solution but exhibit diminished reactivity.

Tris –  tris(hydroxymethyl)aminomethane. Tris is extensively used in biochemistry and molecular biology. The useful buffer range for tris (7-9) coincides with the typical physiological pH of most living organisms. This, and its low cost, make tris one of the most common buffers used in the            biology/biochemistry lab.

DTT – dithiothreitol. A common use of DTT is   as a reducing agent for thiolated DNA. The terminal sulfur atoms of thiolated DNA have a tendency to form dimers in solution, especially in the presence of oxygen. Dimerization greatly lowers the efficiency of subsequent coupling reactions such as DNA immobilization on gold in biosensors.

Klenow fragment

Klenow fragment is the large fragment of DNA polymerase I. It exhibits 5`→3` polymerase activity and 3`→5` exonuclease (proofreading) activity, but lacks 5`→3` exonuclease activity of DNA Polymerase I.

Features:

1)       incorporates modified nucleotides (e.g., biotin-, digoxigenin-, fluorescently-labeled nucleotides);

2)       active in buffers for restriction enzymes, PCR, T4 DNA Ligase.

Applications:

1)       DNA blunting by fill-in 5`-overhangs;

2)       random primed DNA labeling;

3)       labeling by fill-in 5`-overhangs of dsDNA;

4)       DNA sequencing by the Sanger method;

5)       site-specific mutagenesis of DNA with synthetic nucleotides;

6)       second strand synthesis of cDNA.

10X Reaction buffer

500 mM Tris-HCl (pH 8.0 at 25 oС), 50 mM MgCl2, 10 mM DTT.

Inhibition and inactivation

Inhibitors: metal chelators; inactivated by heating at 75 oС for 10 min or by addition of EDTA.

Klenow fragment, as well as DNA polymerase I, requires:

1)       template;

2)       primer;

3)       free 3`-OH end;

4)       deoxynucleoside triphosphates.

*Interesting details. Klenow fragment, as well as DNA polymerase I, catalyzes the incorporation of dNTPs at a maximal rate of 20 nt/sec (approximately).
 

T7 DNA polymerase

A template dependent DNA polymerase, catalyzes DNA synthesis in the 5`→3` direction. It is highly processive DNA polymerase allowing continuous synthesis of long stretches of DNA. The enzyme also exhibits a high 3`→5` exonuclease activity towards single- and double-stranded DNA.

Features:

1)       strong 3`→5` exonuclease activity;

2)       active in buffers for restriction enzymes.

Applications:

1)       purification of covalently closed circular DNA by removal of residual genomic DNA;

2)       primer extension reactions on long templates;

3)       DNA 3`-end labelling;

4)       strand extensions in site-directed mutagenesis;

5)       fill-in blunting of 5`-overhang DNA;

6)       second strand synthesis of cDNA;

7)       in situ detection of DNA fragmentation associated with apoptosis.

10X Reaction buffer

400 mM Tris-HCl (pH 7.5 at 25 oС), 100 mM MgCl2, 10 mM DTT.

Inhibition and inactivation

Inhibitors: metal chelators, modification reagents (acetic anhydride, N-ethylmaleimide inactivate the 3`→5` exonuclease activity but not the polymerase activity); inactivated by heating at 75 oС for 10 min.

Pfu DNA polymerase

A thermostable enzyme of approximately 90kDa isolated from Pyrococcus furiosus. The enzyme replicates DNA at 75oC, catalyzing the polymerization of nucleotides into duplex DNA in the 5´→3´ direction in the presence of magnesium. Pfu DNA Polymerase also possesses 3´→5´ exonuclease (proofreading) activity.

Features:

1)       base misinsertions that may occur during polymerization are rapidly exercised by the proofreading activity of the polymerase;

2)       active in buffers for restriction enzymes.

3)       Pfu DNA polymerase-generated PCR fragments are blunt-ended.

Applications:

1)       sequencing;

2)       primer extension reactions.

Reaction buffer

10 X Buffer: 200 mM Tris-HCl (pH 8.8); 20 mM MgSO4, 100 mM KCl; 100 mM (NH4)2SO4; 1% Triton X-100; 1 mg/ml nuclease-free BSA.

Inhibition and inactivation

Inhibitors: EDTA, chelating agents.

*Lab Shelf

                                                      Triton X -100 – polyethylene glycol

p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether is a nonionic surfactant. Can be used in DNA extraction as part of the lysis buffer. This compound works by disrupting non-covalent bonds in the proteins.

* Interesting details. Pfu DNA Polymerase exhibits the lowest error rate of any thermostable polymerase; reaction rate - is 2kbp/min.

Taq DNA polymerase

Catalyzes the incorporation of dNTPs into DNA. It requires a DNA template, a primer terminus, and the divalent cation Mg2+. Taq DNA polymerase contains a polymerization dependent 5'→3' exonuclease activity. It does not have a 3'→5' exonuclease and thus no proofreading function. Despite this, the enzyme synthesizes DNA in vitro with reasonable fidelity.

Features:

1)       strong 5`→3` exonuclease activity;

2)       30% of amplification products have adenosine monophosphate overhangs;

3)       active in buffers for restriction enzymes.

Applications:

1)       PCR. Taq is stable up to 95°C (isolated from Thermus aquaticus); thus it is not necessary to replenish the enzyme in a 35 cycle PCR . The maximal enzyme activity is between 70-75°C which minimizes secondary structure of the template and results in high polymerization yield. Annealing temps can be chosen from 30-70°C;

2)       Cycle sequencing. It gives more uniform bands than Klenow fragment. The high temperature extension and cycling permits difficult sequences (hairpins) to be sequenced more readily. It can read through homopolymer sequences (i.e. dG:dC) better than Klenow.

Reaction buffer

The enzyme can be diluted in 10 mM Tris (pH 7.6), 0.5 mg/ml BSA, 0.1 mM DTT, 0.1 mM EDTA. Use diluted enzyme the same day.

Inhibition and inactivation

Inhibitors: bromophenol blue, urea, DMSO, formamide and SDS all inhibit Taq to some extent (xylene сyanol (0.02%) does not inhibit this enzyme). Taq is inhibited 47% at a concentration of 10% DMSO. It can still be used for PCR and cycle sequencing of GC rich DNA in the presence of 10% DMSO if the amount of Taq is doubled.

Reaction mixture for a typical PCR amplification:

1)       5х PCR-buffer – 5 µl;

2)       MgSO4, 50 mМ – 1,5 µl;

3)       H2O (distilled) – 3 µl;

4)       dNTP-mіx, 2 mM – 2,5 µl;

5)       Taq-buffer, 5 u/ µl – 0,5 µl;

6)       mineral oil – 10,5 µl; 

7)       2 primers, 3,3 ОD/mol – по 1 µl;

8)       ТЕ-buffer with DNA – 5 µl.

*Lab Shelf

Formamide – it is a clear liquid which is miscible with water and has an ammonia-like odor. In its pure form, it dissolves many ionic compounds that are insoluble in water, so it is also used as a solvent. Formamide is also used as an RNA stabiliser in gel electrophoresis by deionizing RNA. In capillary electrophoresis, it is used for stabilizing (single) strands of denatured DNA.

DMSO - dimethyl sulfoxide. This colorless liquid is an      important polar aprotic solvent that dissolves both polar and nonpolar compounds and is miscible in a wide range of organic solvents as well as water. It has a distinctive property of penetrating the skin very readily, so that one may taste it soon after it comes into contact with the skin. Its taste has been described as oyster- or garlic-like. DMSO is used in PCR to inhibit secondary structures in the DNA template or the DNA primers. It is added to the PCR mix before reacting, where it interferes with the self-complementarity of the DNA, minimizing interfering reactions.

SDS – sodium dodecyl sulfate. It can be used to aid in lysing cells during DNA extraction and for unraveling proteins. SDS is commonly used in preparing proteins for electrophoresis. This compound works by disrupting non-covalent bonds in the proteins, denaturing them, and causing the molecules to lose their native shape (conformation). Also, anions of SDS bind to the main peptide chain at a ratio of one SDS anion for every two amino acid residues. This effectively imparts a negative charge on the protein that is proportional to the mass of that protein (about 1.4 g SDS/g protein).

BSA – bovine serum albumin. In restriction digests, BSA is used to stabilize some enzymes during digestion of DNA and to prevent adhesion of the enzyme to reaction tubes and other vessels. This protein does not affect other enzymes that do not need it for stabilization. BSA is also commonly used to determine the quantity of other proteins, by comparing an unknown quantity of protein to known amounts of BSA.

Polymerase chain reaction

The polymerase chain reaction is a technique for quickly "cloning" a particular piece of DNA in the test tube during 30-40 cycles. Polymerase chain reaction was invented by US biochemist Kary Mullis in 1983. Wide level of opportunities, cheapness and simplicity of PCR allowed this method to be used in different branches of genetic investigations. Natural process of cell replication lies in the base of PCR.

Every cycle consists of three steps: denaturation, annealing of primers, synthesis of DNA strand. For every step there is special temperature and time interval:

1)       denaturation (94 oC, 0.5-1 min);

2)       annealing of primers (35-65 oC, 0.5-1 min);

3)       synthesis (72 oC, 0.5-1 min).

Accurate extraction of DNA, amplification of DNA, and detection of amplification products (electropheresis) provide high quality polymerase chain reaciton. Amount of amplicons of DNA fragment from one cell created during PCR can be foumd with following formula: F = 2n , n-number of cycles.

Fig. 3. Scheme of PCR: I, II, III, – 1st, 2nd and 3rd cycles; 0 – fragment of target DNA; a – denaturation; b – annealing of primers; c –  synthesis

DNA sequencing

Is the method for determining the order of the nucleotide bases in target DNA. As a matrix in DNA sequencing single strand DNA is used. To initiate DNA sequencing with DNA polymerase synthetic primers or natural subfragments got with restriction endonucleases are used. 3’-end of primer must end before DNA part that wil be sequenced. This method was invented by UK scientist Frideric Sanger in 1975 (dideoxy termination method).

Fig. 4. Scheme of DNA sequencing

To reveal sequence of nucleotides in target part of DNA, perform 4 polymerase reations. In each of four reaction mixtures is obligatory to add deoxynucleotide triphosphates (dCTP, dGTP, dTTP, dATP) and DNA polymerase. Beside this, in each of tubes one of dideoxynucleotide triphosphates (ddCTP, ddGTP, ddTTP и ddATP) is added. ddNTP in 3’-position instead of hydroxyl group (OH) contains hydrogen (Н). ddNTP takes part in DNA polymerisation reaction and ends it. In each reaction mixture proportion between dCTP, dGTP, dTTP, dATP and one of ddNTP is 100:1. Because of low concentration of ddNTP polymerase reaction does not end in the beginning of DNA sequencing. At the same time reaction mixture contains big amount of DNA fragments of different length (because of ddNTP connection at different points of growing strand).

Using electrophoresis products of DNA polymerisation are separated and get sequence of target DNA.

ENDONUCLEASES

DNase I

Is an endonuclease that digests single- and double-stranded DNA. It hydrolyzes phosphodiester bonds producing mono- and oligodeoxyribonucleotides with 5`-phosphate and 3`-OH groups.

Features:

1)      the enzyme activity is strictly dependent on Ca2+ and is activated by Mg2+ or Mn2+  ions;

2)      in the presence of Mg2+, DNase I cleaves each strand of dsDNA independently, in a statistically random fashion;

3)      in the presence of Mn2+  ions, the enzyme cleaves both DNA strands at approximately the same site, producing DNA fragments with blunt-ends or with overhang termini of only one or two nucleotides;

4)      DNase is sensitive to physical denaturation, that is why mix gently by inverting the tube, do not vortex.

Applications:

1)       preparation of DNA-free RNA;

2)       removal of template DNA following in vitro transcription;

3)       preparation of DNA-free RNA prior to RT-PCR;

4)       DNA labeling by nick translation in cojunction with DNA Polymerase;

5)       studies of DNA-protein interactions by DNase I;

6)       generation of a library of randomly overlapping DNA inserts. Reaction buffer containing Mn2+ is used.

10X Reaction buffer with MgCl2

100 mM Tris-HCl (pH 7.5 at 25 oC), 25 mM MgCl2, 1 mM CaCl2.

10X Reaction buffer with MnCl2

100 mM Tris-HCl (pH 7.5 at 25 oC, 1 mM CaCl2. Recommended concentration of MnCl2 in 1X reaction buffer is 10 mM.

Inhibition and inactivation

Inhibitors: metal chelators, transition metals, (e.g., Zn) in milimolar concentrations, SDS (even in concentrations less than 0.1 %), reducing agents (DTT), ionic strength  above 50-100 mM; inactivated by by heating at 65 oC for 10 min in the presence of EDTA (use at least 1 mol of EDTA per 1 mol of Mg2+/Mn2+).

Fig. 5. DNase I activity in the presence of Mg2+ or Mn2+ 

Endonuclease IV, E. coli (Endo 4)

              Endonuclease IV recognizes apurinic/apirimidinic (AP) sites of dsDNA and cleaves phosphodiester bond 5` to the lesion generating a hydroxyl group at the 3`-terminus. The enzyme can also act as esterase releasing a 3`-phosphoglycolate or 3`-phosphate from the damaged ends of dsDNA. Endo IV possesses also a 3`→5` exonuclease activity.

Features:

1)       its progression on substrates is sensitive to ionic strength, metal ions, EDTA, and reducing conditions;

2)       substrates with 3`-recessed ends are preferred substrates for the 3`→5` exonuclease activity;

3)       the enzyme has no requirement for Mg2+ but is more active in the presence of Mg2+.

Applications:

1)       studies of DNA damage and repair;

2)       single cell electrophoresis;

3)       antitumour drug research;

4)       DNA structure research;

5)       SNP analysis.

10X Reaction buffer

100 mM Tris-HCl (pH 8.5 at 25 oC), 25  mM MgCl2.

Inhibition and inactivation

Inhibitors: the enzyme is fairly resistant to EDTA during the reaction, but becomes sensitive to even sub milimolar quantities of chelators when no DNA substrate is present; inactivated by heating at 80 oC for 15 min.

Fig. 6. Endonuclease IV activity

Restriction enzymes

              Restriction enzymes recognize specific nucleotide sequences and cleave DNA molecules either within or outside their recognition site. Digestion results in the degeneration of DNA with “sticky” (5`- or 3`-overhang or “blunt” ends).

Common properties

              The phenomenon of host specificity was first observed by Luria and Human in the early 1950s. Nearly a decade later, Arber and and Dussoix predicted its molecular basis. They proposed that host specificity in two-enzyme system: a restriction enzyme, which recognizes specific DNA sequences and cleaves foreign DNA upon its entrance into the bacterial cell, and a modification enzyme (metyltransferase), which protects the host DNA from degradation by its own restriction enzyme. Both restriction and modification enzymes recognize the same nucleotide sequence and together they form a restriction-modification (R-M) system.

              Restriction-modification systems are wide-spread among bacteria and have also been isolated from phage, Archaea and eukaryotic algae viruses. R-M systems have been classified into four types (I, II, III and IV) depending on the complexity of their structure, cofactor requirements, mode of action and sequence cleaved. The best characterized and the most frequently used are type II restriction endonucleases. These enzymes recognize specific 4-8 bp DNA sequences and cleave a DNA sequence either within the recognition site, or at a specified position up to 20 base pairs outside the site.

              Often there is more than one enzyme that recognizes a particular nucleotide sequence. According to restriction enzyme nomenclature, an enzyme with a unique specificity which has been discovered first is called prototype. Subsequently discovered enzymes with the same specificity are termed isoschisomers. An isoschisomer may differ from the prototype in site preferences, reaction conditions, as well as in sensitivity to methylation and exhibition of star activity. Restriction enzymes that recognize the same nucleotide sequence, but cleave DNA at different positions are called neoschisomers.

Site preferemces by restriction endonucleases

              In 1975, Thomas and Davis discovered that EcoRI cleaves its five recognition sites on phage λ DNA at rates that differ by an order of magnitude. Similar examples have been documented for other restriction enzymes. Factors such as flanking sequences, methylation of DNA and the number of cleavage sites appear to influence cleavage efficiency. Cleavage of resistant sites can be significantly enhanced by the addition of cleavable DNA and oligodeoxyribonucleotide containing the recognition site, or spermidine.

Types of restriction enzymes:

1)       type I enzymes cleave at sites remote from recognition site; require both ATP and S-adenosyl-L-methionine to function; multifunctional protein with both restriction and methylase activities;

2)       type II enzymes cleave within or at short specific distances from recognition site; most require magnesium; single function (restriction) enzymes independent of methylase;

3)       type III enzymes cleave at sites a short distance from recognition site; require ATP (but doesn't hydrolyse it); S-adenosyl-L-methionine stimulates reaction but is not required; exist as part of a complex with a modification methylase;

4)       type IV enzymes target methylated DNA.

Star activity

              Restriction enzymes recognize specific nucleotide sequences within DNA molecules. However their recognitionsite specificity can be reduced in vitro. Under certain conditions, enzymes are able to recognize and cleave nucleotide sequences which differ from the canonical site. At low ionic strength, for example, BamHI (with the recognitionsequence GGATCC) is able to cleave the following sequences: NGATCC, GPuATCC and GGNTCC. This phenomenon is called “relaxed” or “star” activity. For most restriction enzyme applications, star activity is not desirable.

              Star activity is the result of:

1)       prolonged incubation (over digestion);

2)       high enzyme concentration in the reaction mixture;

3)       high glycerol concentration in the reaction mixture;

4)       presence of organic solvents, such as ethanol, dimethyl sulfoxide (DMSO) or dimethyl formamide (DMFA), in the reaction mixture;

5)       low ionic strength of the reaction buffer;

6)       suboptimal pH values of the reaction buffer;

7)       substitution of Mg2+ for other divalent cations, such as Mn2+ or Co2+.

In some cases, the termini generated by DNA cleavage with a restriction enzyme at the canonical site have been shown to stimulate enzyme star activity.

Both star activity and incomplete DNA digestion result in atypical electrophoresis patterns that can be distinguished by careful examination of gel images.

Differences between star activity and incomplete digestion

Star activity results in additional DNA bands below the expected bands below the expected bands and no additional bands above the largest expected fragment. These additional bands become more intense, while the expected bands become less intense, when either the incubation time or the amount of enzyme is increased.

Incomplete DNA digestion results in additional bands above the expected DNA bands on the gel. Additional bands disappear when the incubation time or amount of enzyme is increased. No additional bands below the smallest expected fragment are observed.

Certain restriction enzymes (for example, Alol, Taul, EcoRII) remain associated with the substrate DNA after cleavage and cause a change in the mobility of the digestion products during electrophoresis. In these cases SDS is added, solution is heated for 10 min at 65 oC and chill on ice prior to loading on the gel.

Digestion of methylated DNA

DNA methylation is the process of transferring a methyl group from a donor molecule to either cytosine or an adenine by DNA methyltransferases. Such methylation is the most common and abundant DNA modification process in living organisms. Thre types of methylated bases are predominately found in DNA: 1) 5`-methylcytosine (m5C); 2) N4-methylcytosine (m4C); 3) N6-methyladenine (m6A).

              In prokaryotes, DNA cleavage by a cognate restriction enzyme is prevented by the methylation of DNA by a sequnce-specific methyltransferase which is an integral component of every restriction-modification (R-M) system. The majority of E. coli strains used for propagation of plasmid DNA contain two-site specific DNA methyltranferases – Dam and Dcm. The methylase encjded by the dam gene methylates the N6-position of an adenine residue with the GATC sequence. The methylase encoded by the dcm gene methylates the C5-position of the internal cytosine residue within the CCWGG sequence.

              DNA from higher eukaryotic organisms possesses modified 5-methylcytosine residues within CpG or CpNpG contexts. These tissue-specific methylation patterns are heritable. They participate in regulation of gene expression and cellular differentiation.

              In cases where a restriction enzyme target site overlaps a methylation site, the following digestion results are possible: 1) no effect; 2) partial inhibition; 3) complete block.

              To achieve effective DNA  digestion, it is necessary to take into account both the type of DNA methylation and the sensitivity of the restriction enzyme to the type of methylation.

Sigle letter code (for describing sites of restriction enzymes)

R = G or A; Y = C or T; W = A or T; M = A or C; K = G or T; S = C or G; H = A, C or T; V = A, C or G; B = C,G, or T; D = A, G or T; N = G, A, T or C (A, T, G, C – nitrogen bases).

Examples of restriction enzymes

Alul                         

Dam, Dcm, CpG – no effect. Becomes inactivated if heated 20 min at 65 oC. 4 bp from end of DNA is required for complete digestion. The optimal incubation temperature is 37 oC.

              *Interesting details. Generally restriction enzymes are active in PCR buffer.

XceI (NspI)

Dam, Dcm, CpG – no effect. Becomes inactivated if heated 20 min at 65 oC. The optimal incubation temperature is 37 oC.

Tail (MaeII)

To ensure efficiency of digestion, perform the cleavage reaction under paraffin oil. Optimal temperature – 65 oC. If methylation occurs in CpG (in cytosine) site the cleavage is blocked ("CpG" is shorthand for "-C-phosphate-G-", that is, cytosine and guanine separated by a phosphate, which links the two nucleosides together in DNA). Can not be inactivated if heated . 2 bp from end of DNA is required for complete digestion. The optimal incubation temperature is 65 oC.

*Interesting details. H.O. Smith, K.W. Wilcox, and T.J. Kelley, working at Johns Hopkins University in 1968, isolated and characterized the first restriction nuclease whose functioning depended on a specific DNA nucleotide sequence. Working with Haemophilus influenzae bacteria, this group isolated an enzyme, called HindII, that always cut DNA molecules at a particular point within a specific sequence of six base pairs. This sequence is: 5' G T (T or C) ( A or G) A C 3'

     3' C A (A or G) (T or C) T G 5'

They found that the HindII enzyme always cuts directly in the center of this sequence. Wherever this particular sequence of six base pairs occurs unmodified in a DNA molecule, HindII will cleave both DNA strands between the 3rd and 4th base pairs of the sequence.

Restriction analysis

This method is based on the ability of restriction enzymes to find and cleave specific sites of DNA.

Fig. 7. Scheme of restriction analysis

If change in site sequence occurs (mutatation, recombination, methylation of DNA, etc.)  a restriction enzyme loses its ability to carry its function. The basic idea is: different sequences of DNA lead to cutting DNA with restriction enzymes in different sites. Got with restriction enzymes DNA fragments serve as markers of different processes that take place inside the cells of investigated organism.

*Lab Shelf

PEG – polyethylene glycol. PEG is used in a number of toothpastes as a dispersant. PEG is a commonly used as precipitant for plasmid DNA isolation and protein crystallization. When attached to various protein medications, polyethylene glycol allows a slowed clearance of the carried protein from the blood. It replaces water in wooden objects, which makes the wood dimensionally stable and prevents warping or shrinking of the wood when it dries. In the field of microbiology, PEG precipitation is used to               concentrate viruses.

Water -  no tea in the evening without it.

EXONUCLEASES

Exonuclease I (Exo I)

              Exonuclease I (ExoI) degrades single-stranded DNA in 3`→5` direction, releasing deoxyribonucleoside 5`-monophosphates in a stepwise manner and leaving 5`-terminal dinucleotides intact.                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                         

Features:

1)       it does not cleave DNA strands with terminal 3`-OH groups blocked by phosphoryl and acetyl groups;

2)       active in buffers for PCR;

3)       is not suitable for removing 3`-overhangs of dsDNA.

Applications:

1)       primer removal from PCR mixtures;

2)       removal of single stranded DNA containing a 3`-hydroxyl terminus from nucleic acid mixtures;

3)       assay for the presence of single-stranded DNA with a 3`-hydroxyl terminus.

10X Reaction buffer

670 mM glycine-KOH (pH 9.5 at 25 oC), 67 mM MgCl2, 10 mM DTT..

Inhibition and inactivation

Inhibitors: 20 %(w/v) PEG 8000; inactivated by heating at 80 oC for 15 min. 

              Fig. 8. Exonuclease I activity

Exonuclease III

              Exonuclease III (Exo III) exhibits four different catalytic activities:

1)      3`→5` exodeoxyribonuclease activity specific for double-stranded DNA: Exo III degrades dsDNA from blunt ends, 5`-overhangs or nicks, releasing 5`-mononucleotides from the 3`-ends of DNA strands and producing stretches of single stranded DNA. It si not active on 3`-overhang ends of DNA that are at least four bases long and do not carry a 3`-terminal C-residue; on single-stranded DNA;

2)      phosphatase activity: Exo III removes the 3`-terminal phosphate and generates a 3`-OH group;

3)      RNase H activity: Exo III exonucleolytically degrades the RNA strand in RNA/DNA hybrids;

4)      Apurinic/apirimidinic-endonuclease activity: Exo III cleaves phosphodiester bonds at apurinic or apyrimidinic sites to produce 5`-termini that are base-free deoxyribose 5`-phosphate residues.    

              Features:

1)       the rate of DNA digestion by ExoIII depends upon temperature, salt concentration and the molar ratio of DNA to enzyme in the reaction mixture;

2)       optimal reaction conditions should be determined experimentally.

Applications:

1)       creation of  unidirectional deletions in DNA fragments with conjunction with S1 Nuclease;

2)       generation of a single stranded template for dideoxy-sequencing of DNA;

3)       site-directed mutagenesis;

4)       cloning of PCR ptoducts;

5)       preparation of strand-specific probes.

10X Reaction buffer

660 mM Tris-HCl (pH 8.0 at 30 oC), 6.6 mM MgCl2.

Inhibition and inactivation

Inhibitors: metal chelators, p-chloromercuri benzoate (50-90% inhibitory at 0.1 mM); inactivated by heating at 70 oC for 10 min. 

Fig. 9. Exonuclease III activity

DNA LIGASES

T4 DNA ligase

              Catalyzes the formation of a phosphodiester between juxtaposed 5`-phosphate and 3`-hydroxyl termini in duplex DNA or RNA. The enxyme repairs single-strand nicks in duplex DNA, RNA or DNA/RNA hybrids, joins DNA fragments with either cohesive or blunt termini. The T4 DNA Ligase requires ATP as cofactor.

Features:

1)       fast – sticky-end ligation is completed in 10 min at room temperature;

2)       active in buffers for restriction enzymes, PCR and RT (when supplemented with ATP);

3)       PEG solution provides efficient blunt-end ligation.

Applications:

1)       cloning of restriction enzyme generated DNA fragments;

2)       cloning of PCR products;

3)       joining of double-stranded oligonucleotide linkers or adaptors to DNA;

4)       site-directed mutagenesis;

5)       amplified fragment length polymorphism (AFLP);

6)       ligase-mediated RNA detection;

7)       nick repair in duplex DNA, RNA or DNA/RNA hybrids;

8)       self-circularization of linear DNA.

10X T4 DNA ligase buffer

400 mM Tris-HCl), 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 5 mM ATP (pH 7.8 at 25 oС).

Inhibition and inactivation

Inhibitors: is strongly inhibited by NaCl or KCl at>200 mM; inactivated by heating at 65 oС for 10 min or at 70 oС for 5 min.

* Interesting details. Polyethylene glycol (PEG) greatly increases the rate of ligation of blunt-end DNA; molecular weight – 55.3 kDa.

Taq DNA ligase

              Taq DNA ligase catalyzes the formation of a phosphodiester bond between juxtaposed 5´ phosphate and 3´ hydroxyl termini of two adjacent oligonucleotides which are hybridized to a complementary target DNA. The ligation will occur only if the oligonucleotides are perfectly paired to the complementary target DNA and have no gaps between them; therefore, a single-base substitution can be detected. Taq DNA ligase is active at elevated temperatures (45°C-65°C) .

Features:

1)       Taq DNA ligase is not a substitute for T4 DNA ligase;

2)       incorporates phosphorylated oligonucleotides during PCR and ligase chain reaction.

Applications:

1)       allele-specific gene detection using ligase detection reaction and ligase chain reaction;