Методы идентификации токсинов

МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ  ТОКСИНОВ

Микотоксины и контроль

Проблема микотоксикозов не нова. Со времен охоты на ведьм в Сэлеме (XVII в.), когда токсин спорыньи, паразитирующий на ржи, попадая в муку для хлебопечения, вызывал массовые галлюцинации, и до настоящего времени микотоксины продолжают представлять угрозу здоровью как животных, так и людей. В нашей стране наиболее часто встречаются микотоксины: ДОН, или вомитоксин, Т-2 токсин, зеараленон и афлатоксин. Нередки случаи обнаружения в корме фузариевой кислоты и фумонизина, иногда - охратоксина А. Ими чаще всего бывают контаминированы зерновые, а также соевые и подсолнечниковые шроты и жмыхи, в том числе при хранении и продолжительной транспортировке. Причины появления и интенсивного роста грибов в период вегетации и созревания культур, особенно за несколько недель до уборки, еще до конца не выяснены.

В последнее десятилетие  получены данные о том, что некоторые  фунгициды, в частности тебуконазол и флюхинконазол, примененные в недостаточной концентрации, не уменьшали, а наоборот, усиливали контаминацию зерна вомитоксином (ДОН). А недавние исследования, проведенные в Великобритании, показали, что фунгицид азоксистробин, угнетая рост неопасной плесени, одновременно способствовал замещению ее токсиногенными видами грибов рода Fusarium.

Афлатоксины продуцируются грибами Aspergillus flavus, A. Parasiticus. Это сильные гепатоксины. Увеличение их концентрации приводит к разрушению печени и подавлению роста птицы. Токсический эффект усиливается при наличии в корме Т-2 токсина или охратоксина, а также при относительно низких уровнях сырого протеина, метионина и "пограничных" уровнях рибофлавина, витамина D3. Афлатоксин В1 - самый опасный токсин в этой группе (LD50= 6,5-16,5 мг/кг). Однако для бройлеров и утят этот показатель составляет менее 1 мг/кг корма. Наиболее восприимчивы к названным токсинам утята, затем индюшата, гусята, цыплята и фазаны.

При уровне 0,7 мг/кг афлатоксина В1 подавляются рост птицы и синтез ДНК, падает потребление корма. В печени снижается уровень витамина А и повышается содержание жиров. Она увеличивается в размерах, приобретает желтовато-коричневый оттенок, становится рыхлой. Иногда происходит кровоизлияние. Гематокритное число и уровень гемоглобина, а также глобулина и протеина в плазме крови значительно падают при наличии 5 мг/кг корма афлатоксина В1. У несушек снижаются яичная продуктивность и масса яйца и, как у бройлеров, увеличивается содержание жира в печени, меняются некоторые параметры плазмы крови. При уровне афлатоксина 1 мг/кг корма и более в течение 4 недель падает яйценоскость, поскольку ухудшается нормальное транспортирование жира из печени в яйцевод.

Трихотецены (Т-2, ДОН и диацетоксискирпенол) продуцируются грибами из рода Fusarium. Они подавляют метаболизм протеина, вызывают повреждения в ротовой полости птицы. LD50 составляет 5 мг/кг массы тела Т-2 токсина для суточных цыплят и 4 мг/кг для цыплят в возрасте 7 дней, а ДОН - 140 мг/кг. Токсический эффект Т-2 токсина в кормах для бройлеров проявляется по-разному в зависимости от продолжительности его присутствия и концентрации. Например, появляются повреждения слизистой и роговых оболочек полости рта или некротический стоматит, геморрагический энтерит толстого и тонкого кишечников и истончение слизистой (первая неделя), падают темпы роста (вторая неделя), а с третьей недели начинаются дегенерация фабрициевой сумки, оральный некроз, анемия, лимфоидная атрофия. У несушек этот же токсин, если присутствует в кормах 18 дней подряд, вызывает снижение яйценоскости и массы яйца, оральные повреждения. Более продолжительное использование такого корма, даже когда концентрация Т-2 составляет не 16 мг/кг, а наполовину меньше, влечет за собой помимо упомянутых симптомов истончение скорлупы, снижение выводимости, повреждение зоба и мышечного желудка. ДОН (вомитоксин) подавляет массу яйца и скорлупы, если присутствует в кормах от 0,35 до 0,7 мг/кг в течение 70 дней. При выращивании бройлеров ДОН хотя и не вызывает падежа птицы, однако приводит к снижению аппетита у цыплят и, как следствие, к уменьшению их продуктивности.

Из охратоксинов наиболее опасен охратоксин А. Он более токсичен, чем афлатоксин. Значение LD50 для бройлеров составляет 2,1 мг/кг массы тела, в то время как для утят он значительно ниже - 0,5 мг/кг, а для японских перепелов - 16,5 мг/кг. Охратоксин А подавляет синтез протеина и метаболизм углеводов, в частности гликоногеноз, путем ингибирования активности фенилаланин - Т-РНК синтеза - специфического фермента, играющего ключевую роль в начальной стадии синтеза протеина.

Широкодоступные методы определения токсичности представляют собой сомнительные индикаторы (микроорганизмы, кожные пробы), которые практически не позволяют обнаружить микотоксины при их недостаточно высоком уровне, хотя и в этом случае многие из них опасны. Поэтому подобные методы очень часто создают путаницу и ложное представление о качестве кормов.

В настоящее время на птицефабриках  наиболее распространен анализ общей  токсичности кормов по выживанию  простейших микроорганизмов (парамеции, стилонихии, калподы). К сожалению, такой простой метод ничего не говорит о природе токсичности. Это всего лишь качественный индикатор присутствия в корме каких-либо вредных для здоровья компонентов: тяжелых металлов, пестицидов, микотоксинов, прогоркших жиров и т.д. Кроме того, по токсичности для простейших можно лишь условно судить о токсичности для птицы. Метод кожной пробы (мыши, кролики и др.) хотя и более адекватен в данном случае, также не раскрывает причину токсичности. К тому же он трудоемок и долог (5-7 дней), что резко ограничивает его практическое применение.

Для анализа основных микотоксинов существуют и активно совершенствуются в последние годы достаточно точные количественные методы. На наиболее передовых птицефабриках стали применять в последние годы иммуноферментный экспресс-метод. Однако и он эффективен лишь в том случае, если отобранные образцы адекватны составу всего корма.

Проблема заключается  в том, что микотоксины, как правило, крайне неравномерно распределяются в массе зерна или комбикорма. В местах роста плесени концентрация микотоксинов может быть очень высокой. Даже самый лучший современный метод анализа не выявит токсичность, если не будет соблюдена трудоемкая рутинная процедура отбора проб.

Показателен пример, продемонстрированный на Всемирном форуме по микотоксинам в Нидерландах. В табл. 1 представлены результаты анализа 10 проб пищевого арахиса по 5 кг каждая, отобранных из одной партии.

То есть, если специалист будет считать, что образец в 5 кг, отобранный из одного места, достаточно полно отражает качество партии продукта, анализ микотоксинов окажется простой тратой денег и времени. Один из наиболее совершенных и удачных методов отбора проб для анализа на содержание афлатоксина описан в Директиве ЕС (табл. 2).

 

Из таблицы видно, что  из партии в 100 т рекомендовано отобрать 30 кг продукта. Далее они должны быть разделены на три равные части (по 10 кг), тонко помолоты и снова тщательно  перемешаны. Только после этого могут  быть отобраны образцы для лабораторного  анализа, обычно массой 50-200 г. Инструкция требует, чтобы для официального анализа образец содержал не менее 100 000 частиц, для обычного анализа  достаточно 50 000 частиц.

Самая точная аналитическая  техника может дать неверное представление  о качестве продукта, если не будет  применена схема подготовки образца. Однако схема отбора проб, подобная вышеописанной, подчас просто неприемлема на практике. В зависимости от типа продукта, условий выращивания культуры, ее уборки и хранения и в случае подозрения на зараженность корма специалист может сделать выбор в пользу профилактического применения подходящих адсорбентов или других методов уменьшения негативного влияния микотоксинов. И хотя этот подход сопряжен с увеличением стоимости кормов, затраты на регулярный отбор образцов и на выполнение дорогостоящих анализов могут оказаться значительно выше.

Подобно методам определения  токсичности способы борьбы с  микотоксинами также претерпели определенную эволюцию. Первоначально для исключения негативного влияния на здоровье и продуктивность птицы использовались бентониты, цеолиты, затем различные алюмосиликаты (Na, Ca, Mg), включавшие либо органические кислоты, либо ферменты. Как правило, все эти вещества даже при больших нормах ввода (около 1% в рационе) адсорбировали в основном афлатоксин и практически не связывали другие токсины, представляющие не меньшую, а иногда и большую опасность, особенно в случаях токсического синергизма. К тому же бентониты и алюмосиликаты адсорбируют также некоторую часть микроэлементов и витаминов. Так, например, алюмосиликаты и бентониты связывали 18% меди, 14% цинка и кальция. Аналогичная картина наблюдалась и в отношении витаминов, хотя потери здесь были менее значительными. Поэтому высокие нормы ввода в корма бентонитов, цеолитов и алюмосиликатов нередко приводят к потере питательных веществ и вследствие этого к некоторому снижению микроэлементов и витаминов в крови, хотя рацион полностью сбалансирован и его качественные параметры соответствуют рекомендованным нормам.

В последнее время была открыта способность этерифицированных глюкоманнанов, извлеченных из внутренних оболочек дрожжей специально подобранных штаммов, связывать микотоксины. Эта работа имела почти 20-летнюю историю, приведшую к созданию препарата Микосорб. В его составе отсутствуют цеолиты, бентониты, алюмосиликаты. Норма ввода колеблется от 0,2 до 1 кг/т в зависимости от степени токсичности корма. К тому же Микосорб адсорбирует не только афлатоксины, но и ряд других опасных токсинов, включая Т-2, ДОН, охратоксин и др. (рисунок).

 

В табл. 3 приведены сравнительные данные эффективности нескольких адсорбентов, включая этерифицированные глюкоманнаны (Микосорб).[5-8]

Определение микотоксинов при их совместном присутствии в пищевых продуктах [11]

Одно из ведущих мест в  ряду приоритетных загрязнителей пищевых  продуктов принадлежит микотоксинам. В настоящее время известно более 250 различных микроскопических грибов, продуцирующих более 100 токсичных метаболитов. Микотоксины образуются в цепи последовательных ферментных реакций, протекающих по механизмам поликонденсации, окисления-восстановления, алкилирования, галогенизации. Особое внимание к проблеме загрязнения пищевых продуктов микотоксинами обусловлено широкой распространенностью их продуцентов в природе и способностью поражать пищевые продукты на любом этапе их производства. Цель настоящей работы - модификация имеющихся методик тонкослойной хроматографии (ТСХ) для исследований микотоксинов.

Для совместного определения  афлатоксина В1, зеараленона, Т-2 токсина и дезоксиниваленола, содержащихся в одних и тех же продуктах, предложено использовать смесь ацетонитрила и раствора хлорида калия с массовой долей 4% в соотношении 9:1. При разделении микотоксинов на хроматографических пластинках «Силуфол» с силикагелевым покрытием хроматографирование проводилось смесью растворителей гексан : ацетон (1:1). При этом величины R_f: для афлатоксина В1 – 0,45%, , для зеараленона – 0,75%, для Т-2 токсина – 0,4%, для дезоксиниваленола 0,42%. В отдельных случаях предложено использование подтверждающих тестов – спиртовый раствор хлорида алюминия для зеараленона и водный раствор азотной кислоты для всех остальных, при этом флуоресценция зеараленона меняется с зеленоватой на ярко-голубую, а остальных с оттенков голубого и синего на ярко-желтую. Такой подход позволил ускорить выдачу результата и экономно расходовать реактивы и хроматографические пластинки.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АРОМАТИЧЕСКИХ  КИСЛОТ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ [14]

Разработан способ экстракционно-потенциометрического определения бензойной и салициловой  кислот в пищевых продуктах (фруктовые  компоты, варения, джемы, мармелады). Экстракция трет.бутиловым спиртом (высаливатель - сульфат лития) значительно снижает пределы обнаружения кислот. Детектирование осуществляют методом потенциометрического титрования с применением платинового индикаторного электрода и хлоридсеребряного электрода сравнения (кислотно-основной механизм).

Содержание кислот в анализируемом  объекте (m, мг) вычисляют по формуле:

m=0,01^.С^.V^.R^.M,

где С - концентрация титранта (0,01 моль/л раствор КОН в изопропиловом спирте); V - объем титранта, мл; R - степень извлечения кислоты трет.бутиловым спиртом, %.

10 мг/л, продолжительность  анализа 40 мин.»Минимально определяемые концентрации кислот

Предложен способ определения  галловой кислоты в пищевых продуктах (маргарин, жиры, молочные продукты), основанный на экстракционном концентрировании трет.бутиловым спиртом в присутствии сульфата лития и фотометрическом детектировании (окислительно-восстановительный механизм). Минимально определяемая концентрация галловой кислоты - 5 мг/л. Продолжительность анализа 60 мин, ошибка не превышает 10 %.

10%.£Определение галловой и протокатеховой кислот в чае включает экстракционное концентрирование трет.бутиловым спиртом с применением высаливателя (сульфат лития) и детектирование концентрата методом фотометрического титрования (окислительно-восстановительный механизм). Способ позволяет определять галловую и протокатековую кислоты в чае на уровне 50-70 мг/кг сырья. Продолжительность анализа 40-60 мин, погрешность

ПРЯМОЕ НЕПЛАМЕННОЕ  АТОМНО-АБСОРБЦИОННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ  МЫШЬЯКА, СВИНЦА И КАДМИЯ В НЕКОТОРЫХ  ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ [13]

Работа посвящена оптимизации  условий прямого электротермического  атомно-абсорбционного спектрофотометрического (ЭТ ААС) определения микроколичеств (0,002-0,2 мг·кг-1) мышьяка(As), свинца (Pb) и кадмия (Cd) в некоторых пищевых продуктах.

Растворы исследуемых  материалов (0,020-0,040 мл), полученные после  их предварительного автоклавного разложения, наносили на платформу Львова в ЭТ графитовой трубчатой печи, добавляли  модификатор матрицы (ММ) и программировано  нагревали. Установлено, что смесь  гидрофосфата аммония с нитратом палладия и азотной кислотой эффективна при определении Cd; нитрат магния и палладия - при определении As, а дигидрофосфат аммония с нитратом магния и палладия – при определенииr Pb. Использование при ЭТ ААС определении в пищевых продуктах (> 0,002 мг·кг-1) As, Pb и Cd перечисленных ММ и платформы Львова позволяет повысить температуру печи на стадии озоления до 900-950оС и значительно упростить процедуру анализа в целом.

Показана эффективность  использования прямого ЭТ ААС  при анализе некоторых продуктов  питания растительного и животного  происхождения.