Генная инженерия, возможности. Методы генной инженерии в микробной биотехнологии

Генная инженерия, возможности. Методы генной инженерии в микробной биотехнологии.

 

Работу  выполнила

Студентка группы ТЭТД-10

Пилипчук  Евгения

Генетическая  инжене́рия (генная инженерия) — совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы.

Генетическая инженерия -Важная составная часть биотехнологии. Родившись в начале 70-х годов, она добилась сегодня больших успехов. Методы генной инженерии преобразуют клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих в "фабрики" для масштабного производства любого белка. Это дает возможность детально анализировать структуру и функции белков и использовать их в качестве лекарственных средств.

Методы  генной инженерии

 

Наиболее распространенными  методом генной инженерии является метод конструирования и переноса рекомбинантных ДНК. Этот метод включает несколько этапов.

 

1. Создание вектора.

 

Этот  этап состоит из двух последовательных стадий: рестрикции и лигирования.

Рестрикция – означает “разрезание”, “ограничение”. При помощи фермента ,   рестрикционной эндонуклеазы или рестриктазы, открытой в 1974 году швейцарским ученым Вернером Арбером, происходит разрезание плазмидной ДНК, образуется расщепленная плазмида с “липкими” концами, ТТАА и ААТТ. ( Бактериальные клетки вырабатывают рестриктазы для разрушения инородной ДНК, чтобы защищаться от вирусной инфекции.) Этой же рестриктазой разрезают ДНК человека (выделенную из клетки) на множество различных фрагментов, но с одинаковыми “липкими” концами. Поскольку используется один и тот же фермент рестриктаза  “липкие” концы плазмиды и “липкие” концы ДНК человека (чужеродный ген) будут являться комплементарными.

Лигирование - “сшивание”. Фрагменты ДНК человека включают в плазмиды и их комплементарные “липкие” концы “сшивают” ферментом лигазой. Образуется рекомбинантная плазмида.

2. Трансформация – введение.

 

Рекомбинантные  плазмиды вводят в бактериальные клетки (E. Coli), обработанные специальным образом, чтобы они на короткое время стали проницаемы для макромолекул. Однако, плазмиды проникают лишь в часть обработанных клеток.

Схема встраивания гена в  плазмиду  и

введение рекомбинантной плазмиды в бактерию E.coli

 

рестрикция                                 трансформация

 

лигирование

Трансформированные бактерии вместе с плазмидой приобретают устойчивость к определённому антибиотику. Это позволяет отделить трансформированные бактерии от нетрансформированных, так как они погибают на среде, содержащей антибиотик. Чтобы их отделить друг от друга, бактерии высевают на питательную среду так, чтобы клетки находились на расстоянии друг от друга. Каждая из трансформированных клеток размножается и образует колонию из многочисленных потомков – клон.

Трансформация

 

Скрининг

 

Трансформация бактерий и скрининг клонов

 

3. Скрининг – отбор среди клонов трансформированных бактерий тех, которые содержат плазмиды, несущие нужный ген человека.

 

Все бактериальные  колонии покрывают специальным  фильтром. Когда его снимают, на нём  остаётся отпечаток колоний. Затем  проводят молекулярную гибридизацию. Фильтры погружают в раствор  с радиоактивно меченым зондом. 

Зонд – это полинуклеотид, комплементарный части искомого гена (Р³²). Он гибридизируется лишь с теми рекомбинантными плазмидами, которые имеют нужный ген. После гибридизации на фильтр в темноте накладывают рентгеновскую плёнку и через несколько часов её проявляют. Засвечиваются те участки на плёнке, где располагаются клоны трансформированных бактерий с нужным геном. Их отбирают, размножают (клонируют), так как они способны вырабатывать белок, кодируемый этим геном

4. Синтез гена искусственным путём

 

Не всегда удаётся  вырезать точный ген с помощью  рестриктаз. Многие гены расщепляются этими ферментами на несколько частей, некоторые не содержат последовательностей, узнаваемых рестриктазами. Начинается клонирование с целенаправленного получения нового гена. Для этого из клеток человека выделяют и – РНК – копию этого гена. С помощью фермента обратной транскриптазы, открытой в 1970 году Д. Балтимором и Г. Теминым (американские ученые – лауреаты Нобелевской премии) синтезируют коплементарную цепь ДНК. Затем эта цепь ДНК служит матрицей для синтеза обратной транскриптазой комплементарной второй цепи ДНК, которая называется к-ДНК (комплементарная ДНК). Она соответствует гену, с которого считала информация и – РНК, запущенная в систему обратной транскриптазой. Комплементарная ДНК (к – ДНК) встраивается в бактериальную плазмиду, которой трансформируют бактерии и получают клоны, содержащие только выбранные гены человека.